张阳，闫鹤

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aurues，S. aureus)是一种常见的人畜共患病病原菌，能够引发人和动物的局部性化脓感染、肺炎和败血症等疾病[1]，可以在不同动物宿主间传播，具有广泛的宿主适应性[2～4]。据中国卫生统计年鉴2013～2015报告，在2011～2014年内，我国共发生1244起由食源性病原微生物引起的爆发性食物中毒事件，共导致27479人患病，其中由S.aureus引发的患病人数为3269，占比11.9%[5]。该菌是污染猪肉产品引发细菌性食物中毒的主要食源性致病菌之一[6]，S. aureus通过生猪养殖场环境传播至人或污染猪肉产品，无疑会给食品安全和人的健康带来潜在威胁。S. aureus的致病性主要源于其分泌的多种致病因子，这些致病因子包括溶血素、杀白细胞素、脱皮毒素和肠毒素等多种外毒素以及血浆凝固酶和耐热核酸酶等葡萄球菌酶[7]。

凝固酶是S. aureus的一种重要致病因子，能否产生有活性的凝固酶是凝固酶阳性S. aureus与凝固酶阴性葡萄球菌的重要差异之一[8]。导致不同动物血浆凝固的致病因子为S. aureus中clfA基因编码的凝聚因子A（ClfA）、coa基因编码的凝固酶(Coa)、vwb基因编码的血管性血友病因子结合蛋白(vWbp)，其中Coa和vWbp起主要作用[9]。ClfA在抑制S. aureus被宿主免疫细胞吞噬和侵入宿主中起到重要作用[9]。

Coa属于游离凝固酶，仅通过与凝血酶原结合形成葡萄球菌凝血酶复合物，通过位阻作用改变凝血酶原的空间结构从而发挥凝血酶的作用[10]；而vWbp被称为结合凝固酶，vWbp介导的动物血浆凝固是S.aureus致病性的重要体现之一，vWbp能以非蛋白水解的方式活化凝血酶原，改变人类血液的凝血级联反应，从而产生大量不可调控的纤维蛋白聚合体，将S.aureus和血小板形成S. aureus微血栓，从而增加S.aureus在血管中的粘附[11]。

Coa是最早发现于S. aureus中的毒力因子之一，早在1985年就已经发现Coa的氨基酸序列及其基因coa的核酸序列，coa基因分布于所有凝固酶阳性的S. aureus基因组中[12]；直到 2002年，vWbp才被Bjerketorp发现[13]。vWbp共分为两种，一种是由染色体vwbC编码的vWbpC(Chromosomal-encodedvWbp)，另一种是由致病岛vwbS编码的 vWbpS(SaPI-encodedvWbp)。染色体vwbC基因存在于所有的S. aureus中，其编码的vWbp能使兔血浆凝固而不能使牛血浆和羊血浆凝固，对不同动物宿主血浆凝固适应性较差[14]；而致病岛vwbS基因目前在分布于牛源、马源和羊源S. aureus中，其编码的vWbp具有特异性N末端区域，不仅能使兔血浆凝固同时可以使牛血浆、羊血浆、马血浆凝固，对不同动物宿主血浆凝固适应性较强[14]。

目前已知的vwbS基因有 SaPIbov4中的vwbSbo4(GenBank Accession No： HM211303)、SaPIbov5中的vwbSbo5(GenBank Accession No： HM228919)、SaPIov2 中vwbSov2(GenBank Accession No： CP001996)和 SaPIeq1 中的vwbSeq1(GenBank Accession No：HM228920)，其中vwbSbo4和vwbSbo5的具有相同的基因序列，在SaPIbov4和SaPIbov5中方向相反，且均来源于牛源S. aureus[14]。关于vwbS基因及其所在的致病岛、基因功能等信息见表1[14]。

表1 葡萄球菌凝固酶vwb基因的分布、来源及功能[14]Table 1 The distribution, origin and function of staphylococcal coagulase vwbgenes[14]

不同动物宿主分离的S. aureus基因组有明显的差异，表明在不同来源的S. aureus基因组中存在特定宿主适应性基因[4,14]。Sung等[15]研究表明S. aureus宿主适应性基因通常位于可移动元件(mobile genetic elements，MGEs)上，细菌可以通过获得或缺失一个或多个MGEs从而获得不同的宿主适应能力。近年来关于MGEs在细菌耐药基因和毒力基因传播中的重要作用已有较深入的研究[16～19]，但MGEs在细菌对不同动物宿主适应性和致病性方面的研究较少，S. aureus致病岛(Staphylococcal Pathogenic Islands，SaPIs)是一种重要的MGEs，SaPIs中vwbS基因编码的vWbp使不同动物血浆凝固是S. aureus对不同动物宿主适应性和致病作用的重要体现之一[14]。

猪肉在世界肉类食品中销量最大，且一直保持增长势头。我国是生猪养殖大国，生猪出栏量和猪肉产量基本占到世界总量的 50%[20]，但目前国内关于S.aureus对不同动物宿主凝血致病性以及致病岛vwbS凝固酶基因分布的研究较少，因此全面调研生猪养殖及生鲜猪肉食品分离的S. aureus对不同动物宿主凝血致病性以及携带vwbS凝固酶基因的状况对猪肉食品安全和人类健康具有重要意义。

厦门是我国生猪养殖区域之一，该地区饲养的生猪是福建省猪肉食品的主要来源之一，本研究以厦门地区生猪养殖场、屠宰场及生鲜猪肉来源的S. aureus为研究对象，采用血浆凝固酶实验研究猪源S. aureus对兔、牛、羊血浆的凝固活性，探究猪源S. aureus是否具有对不同动物宿主的凝血致病能力，同时结合PCR方法研究猪源S. aureus是否携带S. aureus凝固酶vwbC、vwbSbo4、vwbSov2和vwbSeq1基因，初步了解这4种基因在生猪养殖场环境及生鲜猪肉中S. aureus的分布状况，研究为厦门地区生猪养殖场、屠宰场及生鲜猪肉来源的S. aureus对不同动物宿主的凝血致病作用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

实验菌株为本实验室保存。自2014年9月至12月，在厦门某大型生猪养殖场、屠宰车间、超市和农贸市场共采集的501份样品中分离检出的130株野生型S. aureus，样本来源及菌株分离率状况如表2所示。实验菌株已根据GB 4789.10-2016S. aureus检验标准内容鉴定为S. aureus，且每份样品仅挑选1个单菌落进行S. aureus判定，以避免同一样品分离出多株相同克隆株。

此外，通过PCR方法验证实验菌株均携带凝固酶coa基因。所有实验菌株已完成MLST分型实验，不同来源菌株的ST型别分布情况见表3。实验所用质控菌株为S. aureusATCC29213和S. aureusRN4220。

表2 不同样品中S. aureus的分离情况Table 2 Isolation of S. aureus isolates from different pork productions

表3 不同样品中S. aureus的ST型别分布Table 3 Distribution of ST types among S. aureus isolates from different pork productions

1.2 仪器与设备

Gene Amp PCR system 2700，美国 Applied Biosystems公司；GelDocEQ凝胶成像系统，美国BIO-RAD公司；核酸电泳仪，美国BIO-RAD公司；高速离心机，美国Thermo公司；恒温培养箱，德国Binder公司；恒温培养摇床，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 培养基和主要试剂

脑心浸出液肉汤（Brain Heart Infusion Broth，BHI），广州环凯微生物科技有限公司；细菌基因组DNA快速提取试剂盒，北京博迈德生物技术有限公司；TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）、dNTPs、2000 bp DNAmarker、琼脂糖，日本TaKaRa公司；兔血浆、牛血浆、羊血浆，广州鸿泉生物科技有限公司；溶菌酶，德国Sigma公司。

1.4 方法

1.4.1 菌株的活化及DNA的提取

将保存于实验室-80 ℃冰箱的菌株划线接种至BHI琼脂平板，在37 ℃的恒温培养箱中过夜培养，然后挑取单菌落至BHI肉汤中，37 ℃培养10～16 h。S.aureus的DNA提取按照细菌基因组DNA快速提取试剂盒说明书进行。

1.4.2 血浆凝固酶实验

分别取0.5 mL新鲜兔血浆、牛血浆和羊血浆分装于无菌试管中，再各加入含1×108CFU/mL待检菌株肉汤过夜培养物0.2 mL，置于37 ℃恒温培养箱内，每隔30 min观察一次并记录实验结果，连续观察6 h。评定结果：如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。S. aureusATCC29213和S. aureusRN4220分别作为阳性和阴性对照。

1.4.3 血管性血友病因子结合蛋白基因vwb的扩增及引物的合成

为验证实验菌株是否携带S. aureus凝固酶vwbC、vwbSbo4、vwbSov2和vwbSeq1基因，所有菌株进行这4种vwb基因的PCR扩增，PCR阳性产物送至上海美吉生物医药科技有限公司测序，将测序结果在www.ncbi.nlm.Nih.gov 网站对测得的序列进行分析，应用Standard Nucleotide BLAST对获得的基因序列进行同源性检索。引物均由上海生工生物股份有限公司合成。引物序列及片段长度如表4所示。

表4 vwb基因引物序列与PCR扩增产物大小Table 4 The information of vwb and its primer sequence and size of the amplification product by PCR

1.4.4 数据处理

采用spss 19.0软件进行统计学处理，计数资料用χ2检验，p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 血浆凝固酶实验结果

2.1.1S. aureus对不同动物血浆的阳性凝血率

不同来源的S. aureus对兔血浆、牛血浆和羊血浆的血浆凝固酶实验结果见表5。

130株S. aureus对兔血浆、牛血浆和羊血浆的阳性凝血率分别为100.00%、28.46%和28.46%。不同来源的S. aureus对3种不同动物血浆的阳性凝血率不同。生猪养殖场分离株对3种血浆的阳性凝血率最高，均为100.00%；屠宰场和终端市场分离的S. aureus对兔血浆的阳性凝血率为100.00%，但对牛血浆和羊血浆的阳性凝血率均较低，屠宰车间分离株对牛血浆和羊血浆的阳性凝血率均为11.29%，终端市场分离株对牛血浆和羊血浆的阳性凝血率均为2.56%。

表5 130株S. aureus血浆凝固酶实验结果Table 5 The result of coagulase test with 130 S. aureus isolates from different pork production

2.1.2 不同动物血浆的菌株凝血速率

本研究中不同来源的S. aureus对兔血浆、牛血浆和羊血浆的凝血速率存在差异，S. aureus对兔血浆的凝血速率快于对牛血浆和羊血浆的凝血速率。130株S. aureus对兔血浆的阳性凝血率为100.00%，且在0.5 h内使兔血浆达到完全凝固。实验菌株对牛血浆和羊血浆凝固酶速率实验结果如表6和表7所示，生猪养殖场中猪鼻拭纸和养殖环境分离的S. aureus均可使牛血浆和羊血浆在1 h内完全凝固，而屠宰车间和终端市场生鲜猪肉分离的S. aureus中分别只有6株和1株S. aureus可以使牛血浆和羊血浆在1 h内完全凝固。此外，屠宰场生鲜猪肉分离株中有1株S. aureus可以同时使牛血浆和羊血浆在4 h内完全凝固。通过分析不同来源的S. aureus对兔血浆、牛血浆和羊血浆凝血速率实验结果发现，生猪养殖场分离株对3种血浆的凝血速率快于屠宰场和终端市场分离株。

表6 130株S. aureus牛血浆凝固酶速率实验结果Table 6 The result of bovine plasma coagulase test with 130 S. aureus isolates from different pork production

表7 130株S. aureus羊血浆凝固酶速率实验结果Table 7 The result of caprine plasma coagulase test with 130 S. aureus isolates from different pork production

2.2 S. aureus中致病岛凝固酶基因vwbSbo4和vwbSov2的分布情况

130株实验菌株中vwbC、vwbSbo4、vwbSov2和vwbSeq1基因的扩增结果见图1。由图1可知，除vwbSeq1基因在实验菌株中未检出外，S. aureus凝固酶vwbC、vwbSbo4、vwbSov2基因均扩增出相应目标条带，且与GeneBank中对应目的基因的同源性为99%。

图1 vwbC、vwbSbo4、vwbSov2和vwbSeq1基因PCR扩增结果Fig.1 The amplification results of vwbC, vwbSbo4, vwbSov2 andvwbSeq1genes by PCR

根据PCR的检测结果，130株S. aureus中vwbC、vwbSbo4和vwbSov2凝固酶基因的检出率分别为100.00%，26.92%和29.23%，结果见表8。不同样本来源的S. aureus中均以vwbC基因的检出率最高，达100.00%，说明vwbC基因存在于所有的S. aureus染色体基因组中，与David Viana等的研究结论一致[14]。本研究中vwbSbo4、vwbSov2、vwbSeq1基因的检出率明显比vwbC基因的检出率低，其中vwbSbo4检出率为26.92%，高于 David Viana研究中vwbSbo4的检出率18.42%；vwbSov2检出率为29.23%，高于David Viana研究中vwbSov2的检出率 23.68%，但值得注意的是David Viana研究中vwbSbo4和vwbSov2基因全部分布在牛、羊和马源的金葡菌中，在猪源S. aureus中并未检出[14]，而本研究中vwbSbo4和vwbSov2基因全部分布于猪源S. aureus中。此外，Caitriona M等对牛和羊乳腺炎来源的29株S. aureus研究发现有37.93%（11/29）的菌株携带有vwbSov2基因[4]，高于本研究猪株S.aureus中vwbSov2的检出率29.23%。目前国内对vwbSbo4和vwbSov2基因流行情况的研究相对较少，2016年Yan等利用全基因组测序技术对中国哈尔滨健康生猪分离的3株S. aureus进行基因结构分析中，发现3株S.aureus全部携带有vwbSbo4基因[21]。不同来源S. aureus中vwbSbo4和vwbSov2基因的检出率有所不同，这可能与实验菌株数量或采样地点、国家等因素有关。

不同来源的S. aureus中vwbSbo4和vwbSov2基因的携带率不同，并且存在一定的差异。生猪养殖场中猪鼻拭纸样品和环境样品分离S. aureus中vwbSbo4具有相同的检出率，均为95.45%；vwbSov2在猪鼻拭纸样品和环境样品分离S. aureus中的检出率也相同，均为85.71%。屠宰场生鲜猪肉样品分离S. aureus中vwbSbo4和vwbSov2的检出率分别为11.29%和12.90%，终端市场生鲜猪肉样品分离S. aureus中vwbSbo4和vwbSov2的检出率分别为2.56%和7.69%。实验结果表明S. aureus致病岛凝固酶基因vwbSbo4和vwbSov2在生猪养殖场分离S. aureus中的检出率明显高于在屠宰场和终端市场分离S. aureus的检出率，且差异具有统计学意义（p＜0.05）。

从总的分布规律来看，菌株同时携带有vwbSbo4和vwbSov2基因的几率较高，在生猪养殖场中，95.45%（21/22）的猪鼻拭纸样品分离株和 85.71%(6/7)环境样品分离株同时被检测出vwbSbo4和vwbSov2；在屠宰场和终端市场生鲜猪肉样品分离株中分别有 6株S.aureus和1株S. aureus同时携带vwbSbo4和vwbSov2基因，结果表明生猪养殖场分离的S. aureus同时携带vwbSbo4和vwbSov2的比率高于生鲜猪肉样品分离的S.aureus，说明生猪养殖场中S. aureus更易捕获致病岛凝固酶vwbSbo4和vwbSov2基因，可能是由于活猪或养殖环境作为S. aureus的传播媒介更容易被定殖或感染多种来源的S. aureus。

表8 130株S.aureus中不同类型vwb基因的检出率Table 8 Detection of different kinds of vwb genes in 130 S. aureus isolates from different pork production

2.3 血浆凝固酶实验与 vwb基因检测结果对比分析

从兔血浆凝固酶实验表型和相应的凝固酶基因检测结果分析，130株猪源S. aureus均能使兔血浆在0.5 h内凝固，且实验菌株均携带凝固酶vwbC和coa基因，说明所有实验菌株的兔血浆凝固酶表型与其所携带的凝固酶基因表达结果保持一致。

从牛和羊血浆凝固酶实验表型与相应的凝固酶基因检测结果分析，130株S. aureus中，54.62%(71/130)的S. aureus对这两种血浆的凝固酶表型均为阴性，且不含vwbSbo4和vwbSov2基因，说明本研究中牛血浆和羊血浆凝固酶表型与所携带的vwbSbo4和vwbSov2基因结果一致。在牛和羊血浆凝固酶阳性表型和相应的凝固酶vwbSbo4和vwbSov2基因阳性菌株中，26.92%(35/130)的S. aureus（尤其是生猪养殖场分离株）同时携带有vwbSbo4和vwbSov2基因，且可以使牛血浆和羊血浆在1 h内完全凝固，这一结果表明可能是vwbSbo4和vwbSov2两种基因协同作用促使S. aureus对牛血浆和山血浆具有较快的凝血速率；在屠宰场生鲜猪肉分离株中有 1株携带vwbSbo4基因的S. aureus可以使牛血浆和羊血浆在4 h内凝固，而3株携带vwbSov2基因的S. aureus不能使牛血浆和羊血浆在实验观察6 h内凝固，说明vwbSbo4基因的凝血致病作用比vwbSov2基因的凝血致病作用强。此外，实验发现在生猪养殖场环境样分离的S. aureus中有1株不携带有vwbSbo4和vwbSov2基因，但能使牛血浆和羊血浆在1 h内凝固，说明在S. aureus中可能存在其他机制导致牛血浆和羊血浆凝固，这一现象需要进一步深入研究。

3 结论

3.1 本实验首次检测到猪肉生产链中生猪养殖场、屠宰场和终端市场三个环节分离的S. aureus对兔血浆、牛血浆和羊血浆具有凝血致病作用，同时通过PCR扩增检测到vwbC，vwbSbo4和vwbSov23种S. aureus凝固酶基因，说明猪源S. aureus对不同动物宿主具有适应性和凝血致病作用。

3.2S. aureus凝固酶vwbC基因的检出率最高，vwbSeq1基因未检出，vwbSbo4和vwbSov2的检出率在生猪养殖场猪鼻拭纸和养殖环境分离的S. aureus明显高于屠宰场和终端市场生鲜猪肉分离的S. aureus。

3.3 所有菌株对兔血浆凝固酶实验表型为阳性，且均在0.5 h内凝固，对牛血浆和羊血浆凝固酶实验表型多样，生猪养殖场中猪鼻拭纸和养殖环境分离S. aureus对牛血浆和羊血浆的阳性凝血率和速率快于屠宰场和终端市场生鲜猪肉分离S. aureus。

3.4 通过血浆凝固酶实验和vwb基因检测结果对比分析发现：S. aureus同时携带有vwbSbo4和vwbSov2基因对牛血浆和羊血浆的凝血速率比只携带vwbSbo4或vwbSov2基因对牛血浆和羊血浆的凝血速率快，这一现象可能是vwbSbo4和vwbSov2两种基因协同作用的结果；存在1株S. aureus不携带vwbSbo4和vwbSov2基因，但可以使牛血浆和羊血浆在1 h内完全凝固，可能是S.aureus中可能存在其他机制导致牛血浆和羊血浆凝固，这一现象需要进一步实验研究。