王思奇(综述) 蒋 炜(审校)

(复旦大学附属中山医院消化科 上海 200032)

慢性肝病及其相关的肝纤维化、肝硬化和肝癌严重危害我国人民健康。肝纤维化是对慢性肝损伤的修复反应,有多种细胞及介质参与,是慢性肝病向肝硬化发展的必经中间环节及可逆阶段[1]。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化在肝纤维化中占主导地位,肝中一系列的细胞及细胞因子通过影响HSCs的增殖、趋化、收缩及胶原合成,参与肝纤维化的发生和发展[2]。各种损伤因素刺激肝脏时,可导致肝中固有的细胞和肝脏免疫细胞的免疫表型及功能发生改变,这种病理状态下的免疫应答造成肝脏局部免疫稳态以及微环境的改变,进而导致疾病慢性化以致纤维化[3]。对肝脏免疫微环境的研究极大地丰富了我们对肝纤维化的理解,也为疾病的治疗开拓了广阔领域。

肝脏固有细胞

肝细胞 肝脏中约80%由肝细胞组成,尽管肝细胞的主要作用是物质代谢、蛋白质合成和毒素中和等,但也能发挥免疫细胞的功能。肝细胞负责大多数急性期蛋白质和补体的合成,两者是抵御病原体的第一道防线,它们不仅具有免疫效应,还可以结合到特定的微生物的表面,增强病原体的检测[4]。此外,肝细胞有天然免疫受体表达,识别病原体相关配体,以诱导肝细胞固有免疫应答,从而减弱病原体的复制,减少炎症细胞因子的分泌[5]。

同时,肝细胞也可触发适应性免疫应答。肝细胞可表达主要组织相容性复合体-Ⅰ (major histocompatibility complex-Ⅰ,MHC-Ⅰ)类分子、抗原提呈相关分子,在炎症条件下,部分肝细胞还可被诱导表达MHC-Ⅱ类分子,这些分子向肝细胞的基底外侧面极化,从而与淋巴细胞相互作用并促使其活化[6]。肝细胞广泛的免疫功能使其成为肝脏免疫微环境的重要组成部分,其在肝纤维化中发挥作用的免疫机制有待进一步研究。

肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs) 通常情况下,肝脏处于免疫耐受状态,LSECs在肝脏局部免疫稳态维持中起着重要作用,可阻断针对抗原的适应性免疫反应,诱导调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)的产生或维持CD 8+T细胞处于免疫耐受状态[7]。而肝纤维化发生后,肝脏局部纤维化微环境的改变促使LSECs的功能由诱导免疫耐受转变为激活免疫反应,不仅刺激T细胞分泌IL-6、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)等促炎细胞因子,还能高效捕获抗原,刺激抗原特异性T细胞增殖且抑制Tregs产生[8-9],进而活化HSCs。因此,在正常情况下,LSECs将HSCs维持在静息状态;反之,肝纤维化时,LSECs促进HSCs活化,加速肝纤维化进展。

肝脏免疫细胞

库普弗细胞(Kupffer cells,KCs) 肝中KCs含量丰富,表型多样,通常根据来源不同,分为传统的KCs和由外周血单核细胞募集到肝脏的KCs,两者功能亦有差异。

在小鼠体内,传统的KCs起源于胚胎卵黄的干细胞,驻存于肝脏,并不断自我更新,维持肝脏免疫稳态[10]。在慢性肝损伤情况下,KCs可以分泌转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)来活化HSCs[11]。另一类KCs由外周血Ly-6Chi单核细胞通过C-C类趋化因子配体2(C-C chemokine ligand 2,CCL2)/C-C类趋化因子受体2(C-C chemokine receptor 2,CCR2)或CCL1/CCR8趋化通路募集到受损肝脏。这类KCs又可分为两群[12-13]:一群即刚募集到肝的巨噬细胞,表型为CD11b+F4/80+,其除了直接刺激活化HSCs外,还分泌IL-1β和TNF,进而激活核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB) 通路,促使HSCs存活[11]。另一群在C-X-3C类趋化因子受体1(C-X-3C chemokine receptor 1,CX3CR1)作用下发育成熟[14],其表型为Ly-6Clow[15],这群募集到肝脏后分化成熟的巨噬细胞,不同于传统的M1、M2,其分泌基质金属蛋白酶-9、12、13(matrix metalloproteinase 9、12、13,MMP-9、12、13)降解细胞外基质,同时引起HSCs凋亡[16]。综上所述,新募集到肝脏的单核细胞促进肝脏纤维化,而在肝脏成熟后,则促使肝脏恢复稳态。由此可知,肝中KCs有高度异质性,不仅仅局限于传统的M1、M2分类。细胞不同的起源,在肝脏免疫微环境下受到不同的刺激,均影响KCs的表型及功能。

人的肝脏内的KCs由经典的CD14++CD16-巨噬细胞、非经典的CD14+CD16+巨噬细胞及CD16++细胞组成[17]。肝纤维化进程中的KCs部分由非经典巨噬细胞从外周募集到肝脏,另一部分是在TGF-β、IL-10作用下由CD14++CD16-细胞分化而来[18]。研究发现,尽管人肝中的CD14+CD16+细胞与小鼠肝内Ly-6Clow细胞表型相同[19],但CD14+CD16+巨噬细胞可分泌TNF、IL-6、IL-8、IL-1β以及IL-13,活化HSCs,促进肝纤维化[17]。人体与小鼠的差异使得针对KCs的纤维化治疗尚需进一步研究。

树突状细胞(dendritic cells,DCs) DCs凭借专职抗原提呈作用和迁移能力,成为固有免疫与适应性免疫之间重要的纽带。肝纤维化发生后,肝脏中DCs数量扩增且表型发生改变,通过TNF-α刺激邻近的T细胞和自然杀伤细胞(natural killer cells,NK)产生大量炎症因子,并上调HSCs表面的细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和CD40分子表达,使HSCs增殖、活化,进而分泌多种细胞因子与趋化因子,加重肝纤维化[20]。

在CCL4致小鼠肝纤维化的逆转阶段,肝脏DCs数量明显增多,而敲除经典的DCs后,减少了对活化HSCs的清除,并延缓了肝纤维化逆转进程[21]。此外,酪氨酸激酶受体3配体(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand,Flt3L)的应用诱发了DCs扩增,伴随MMP-9分泌增多,加速了肝纤维化逆转,MMP-9不仅能直接降解肝脏中的胶原,还能募集巨噬细胞、中性粒细胞等固有免疫细胞,进而分泌MMP-8、MMP-13降解胶原[21]。DCs在肝脏纤维化进程中发挥双面作用,即在肝纤维化进展阶段有加重纤维化的作用,而当致纤维化因素消除后,则发挥肝脏保护作用。

NK细胞及NKT细胞 肝脏中有丰富的NK细胞,NK细胞可通过TNF相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)、自然杀伤细胞2族成员D(natural-killer group 2 member D,NKG2D)及Fas-Fas配体(Fas ligand,FasL)依赖的途径杀伤活化的HSCs,进而抑制肝纤维化,但静息状态的和完全活化的HSCs则可以躲避NK细胞的杀伤,因为其表面缺少NK细胞激活配体和TRAIL受体[22-23]。此外,NK分泌的IFN-γ可直接抑制HSCs活化,并且NK细胞还通过信号转导与转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)途径抑制HSCs增殖,减弱TGF-β信号转导,增强对HSCs的细胞毒作用[23-24]。近来研究发现,在慢性乙型肝炎相关的肝硬化患者病情进展阶段,肝内NK细胞所产生的IFN-γ和穿孔素明显减少,即NK细胞的功能被显著抑制,这一研究又丰富了我们对NK细胞免疫功能的认识[25]。

除了肝脏本身富有的NKT细胞外,在肝纤维化条件下,外周NKT细胞还可通过CXCR6-CXCL16途径募集到肝脏并发挥作用[26]。NKT细胞可通过不同途径作用于不同病因所致的肝纤维化。在硫代乙酰胺所致肝纤维化模型中,NKT细胞不仅能产生IL-4和IL-13活化HSCs,还能产生IFN-γ,活化巨噬细胞促进肝脏炎症,加重肝纤维化[27]。而在非酒精性脂肪性肝病相关的肝纤维化模型中,NKT细胞可通过产生刺猬配体和骨桥蛋白活化HSCs,促进纤维化[28]。

固有淋巴细胞(innate lymphoid cells,ILCs) ILCs共同起源于CD127(IL-7Rα+)淋巴祖细胞,并根据细胞表型、分化所需的转录因子及功能特征的不同将其分为3组:第1组(ILC1s),表达转录因子T-β,分泌细胞因子IFN-γ;第2组(ILC2s):表达转录因子GATA3,分泌细胞因子IL-4、IL-5和IL-13;第3组(ILC3s):表达转录因子维甲酸相关孤核受体γt (RAR-related orphan receptor γt,RORγt)分泌细胞因子IL-17和IL-22[29]。由上可见,ILCs可表达与辅助性T细胞(helper T cells,Th)类似的转录因子并分泌相似的细胞因子。这些ILCs亚群可能代表不同的淋巴细胞谱系,并且在不同的免疫应答中有其独特的效应功能。

ILCs参与肝脏局部免疫调控的研究刚起步,在CCL4致肝纤维化的小鼠模型中,损伤的肝细胞所释放的IL-33促使ILC2s在肝脏中聚集活化,并分泌IL-13促进HSCs活化,加重肝纤维化进程[30]。同样,在刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)引起的急性肝炎模型中,ILC2s也有促炎作用[31]。亦有文献报道,ILC3s在CCL4诱导的小鼠肝炎模型中通过分泌IL-22起到肝脏保护作用[32]。目前对ILCs的研究主要集中在肠道、肺部等,其在肝脏纤维化免疫微环境中发挥什么作用,如何发挥作用,尚需进一步研究。

CD4+T细胞 根据表达转录因子及分泌细胞因子的差异可将CD4+T细胞分为多个亚群,包括Th1,Th2、Th17、Th22、Tregs等,各群体主要通过自身分泌的细胞因子发挥作用。以往研究多关注Th1与Th2,其中Th1在IL-12作用下分泌IFN-γ等细胞因子,通过调节MMP与金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)的平衡来发挥抗肝纤维化的作用[33];而Th2分泌的IL-13通过诱导产生胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和TIMP-1促进肝纤维化[34]。

近年来,Th17与Tregs在肝纤维化中的作用受到更多重视与关注。Th17可分泌IL-17、IL-22、IL-21等细胞因子,据报道在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关的肝纤维化患者外周血及肝脏中IL-17+CD4+T、IL-21+CD4+T表达较正常人明显升高,并且与肝脏炎症水平及纤维化程度呈正相关[35-36]。实验证明IL-17可作用于HSCs、KCs、单核细胞、肝细胞和胆管细胞等,不仅诱导IL-1β、IL-6、TNF等促炎因子的分泌以及TGF-β产生,还能通过STAT3途径直接诱导产生胶原[37]。此外,细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)1/2和p38信号通路的活化也是IL-17诱导肝纤维化的重要机制[38]。同时,IL-21活化HSCs的作用也在体外实验中得到证实[36]。而IL-22可作用于表达IL-22R1和IL-10R2的HSCs,活化STAT3-细胞因子信号通路抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)-p53信号通路,促进HSCs存活,但又将其维持于静息状态,表现为肝脏中MMP-9表达的上调及TIMP-1/2表达的抑制[39],同时IL-22也能直接减弱HSCs的活化并下调促炎因子的表达,减轻肝纤维化[40]。对于Tregs在肝纤维化中的作用,实验证实胆道结扎大鼠模型在清除Tregs后,肝内的T细胞功能恢复,但胆汁淤积、肝纤维化程度更为明显,说明Tregs负性调节肝脏中的免疫反应,并限制了炎症反应的危害[41]。实验表明,乙肝相关的肝纤维化患者外周血中IL-10和IL-35升高,Tregs可能是通过细胞因子发挥上述作用,这种炎症抑制性分子减少了免疫病理损伤,但也因此抑制对病原体的清除,从而加重病毒感染[42-43]。

我们研究发现,乙肝肝纤维化进程中,肝组织及外周血Tregs/Th17表现为向Th17偏移及相关细胞因子分泌的改变,其稳态的改变可调控HSCs的促纤维化功能并影响肝纤维化进程[44],重塑CD4+T细胞对HBV的免疫应答[45]是抗病毒治疗延缓乙肝肝纤维化进程的新机制。

B细胞 就乙型肝炎而言,B细胞相关研究主要集中在乙肝疫苗注射后对于保护性抗体的产生和效价的维持,近年来的相关研究提示B细胞在肝纤维化的发生、发展中绝不是旁观者,其可通过不依赖抗体的方式影响肝纤维化进程[46]。已有文献证明给予B细胞敲除的小鼠注射CCL4,其肝脏纤维化程度明显低于正常对照小鼠,说明B细胞有促纤维化作用,并且上述作用不依赖抗体和T细胞[47],而可能是通过分泌的IL-6发挥作用[46]。丙肝相关的肝纤维化患者外周血中的记忆性B细胞而不是原始B细胞数量较正常人明显减少,其原因可能是记忆性B细胞表达CD83增多,募集到了炎症状态的肝脏,或因为细胞正处于活化后凋亡阶段[48-49]。记忆性B细胞在肝纤维化中的具体作用机制及表面分子表达对疾病发展的预测作用有待进一步研究。

B细胞除了通过产生抗体发挥作用外,也像CD4+T细胞一样分泌细胞因子,如调节性B细胞(regulatory B cells,Bregs)通过分泌IL-10,诱导免疫耐受,维护环境稳态[50],我们在体外实验中证实,慢性乙型肝炎及其相关的肝纤维化患者的Bregs可通过细胞间接触和分泌IL-10来抑制Th1和Th17的功能,并诱导CD4+CD25-T细胞向Tregs转化,使抑制性细胞因子分泌增加,从而抑制炎症反应,促进炎症修复[51]。Bregs在肝纤维化中的作用及其机制有待进一步阐明。

HSCs对淋巴细胞的作用HSCs是肝纤维化发生、发展中的关键细胞,在肝纤维化进程中,HSCs与各种免疫细胞相互作用构成完整的肝纤维化免疫网络。我们既往研究证实纤维化微环境的改变可使HSCs获得迁移的特性[52],且有学者在荧光电镜下观察到HSCs可与淋巴细胞直接接触,这暗示着HSCs与淋巴细胞之间存在密切关系[53]。HSCs可通过与淋巴细胞直接接触,上调表达黏附分子[54],进而募集淋巴细胞;或分泌MCP-1、IL-8、巨噬细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)、嗜酸性粒细胞趋化因子、CXCL9及CXCLl0等趋化因子募集淋巴细胞[55]。

研究表明,在炎性刺激下HSCs抗原提呈相关分子表达增加,活化T细胞[56]。活化的HSCs还可表达抑制性分子B7-H1,与T细胞表面PD-1结合后诱导T细胞凋亡[57],HSCs也可表达B7-H4抑制T细胞活化[58]。而在稳态下HSCs并不表现出上述功能[6]。

HSCs分泌的多种细胞因子可影响淋巴细胞分化,其中TGF-β1诱导T细胞向Tregs分化[59],IL-6则诱导Th17方向的分化。视黄酸(retinoic acid,RA)可促进TGF-β1却抑制IL-6对T细胞的诱导分化作用[60-61]。RA还可通过髓样分化因子88信号途径促使B细胞存活,增加细胞活化程度,诱导免疫球蛋白G的产生及TNF-α、MCP-1和MIP-1α等促炎因子的分泌[62]。

肝纤维化

肝纤维化免疫微环境的复杂性 肝纤维化免疫微环境之所以复杂,不仅因为有多种细胞参与,更因为细胞存在着不同的亚型,且在疾病进展的不同阶段发挥不同的作用。由上述讨论可知,在肝纤维化进展DCs可加重纤维化,而当致纤维化因素消除后,则对肝脏有保护作用。此外,人体和小鼠肝内表型同为Ly-6Clow的KCs却发挥相反的作用。这提示我们不仅要分析某一群细胞的作用,更要研究一群细胞中细胞的多样性,深入到不同致病因素作用下、疾病不同阶段、不同微环境中细胞的表型和作用。近年来的单细胞测序技术可以明确单个细胞的作用,如将这一检测应用到肝纤维化免疫微环境的研究中,将会极大丰富现有的免疫网络,为肝纤维化的研究提供更多的思路。

肝纤维化研究模型的局限性 在不同病因所致的肝纤维化模型中,免疫微环境存在很大差异。上述NKT细胞在不同纤维化模型中通过不同途径发挥促纤维化作用。在人群中引起肝纤维化的多为HBV。但小鼠并不感染HBV,黑猩猩虽然是HBV易感宿主[63],但动物价格及来源限制了模型的普及。人源化乙型肝炎小鼠模型、HBV转基因小鼠及高压水动力转染小鼠模型虽然模拟了HBV在人体中的感染、复制等过程,但HBV诱导的肝纤维化及肝脏抗病毒免疫反应的建立尚不能很好地实现。因此,建立良好可行的HBV致肝纤维化的动物模型将会更精准地研究免疫微环境在肝纤维化中的作用,更有利于研究的临床转化。

对免疫微环境研究的延伸 细胞代谢相关的生理活动,如细胞自噬、外泌体分泌等,在维持细胞自身稳态中有重要的作用,同时也参与多种疾病过程。近期我们的研究发现,乙肝慢性化进程中高迁移率族蛋白B1诱导的Tregs自噬是Tregs细胞维持自身功能的重要机制[64],在今后的研究中,将细胞相关的代谢活动与肝纤维化免疫微环境研究相结合,探讨相互之间的关系,将会更全面、更深入地了解肝纤维化的发生发展。

移植到肝脏的干细胞有向肝样细胞方向分化的能力,分泌相关细胞因子,发挥抗纤维化、抗氧化的作用,已有临床试验证明干细胞移植对肝纤维化有逆转作用[65]。外来移植免疫细胞到肝脏使肝脏免疫微环境网络更加复杂,也将影响肝纤维化进程,明确其中的机制将极大丰富肝纤维化微环境,为肝纤维化治疗提供更好的理论基础。

依据现有的肝纤维化免疫微环境研究,根据细胞比例、表型,免疫分子的改变,有效地对疾病进行诊断及预后评估;抑或通过干预机体免疫细胞、免疫细胞效应分子,进而影响免疫微环境,治疗肝纤维化。上述这些新思路的应用还有待进一步验证。

结语肝脏免疫微环境是由多种细胞及免疫分子构成的复杂的动态网络系统,肝纤维化与肝脏免疫微环境之间相互影响,相互作用(图1)。肝脏免疫微环境在肝纤维化中的作用有很好的发展前景,但是尚有许多问题需要解决。

In liver fibrosis,LSECs could promote progression of fibrosis by inhibiting effects of Tregs and stimulating proinflammatory cytokines secretion of T cells.Infiltrated monocytes in the liver could be classified into CD11b+F4/80+and Ly-6Clowgroups according to their phenotypes.The first group could secret IL-1β and TNF to contribute to HSCs survival.The second group could induce the apoptosis of HSCs and degrade extracellular collagens.Resident liver macrophages activate HSCs through secreting TGF-β and PDGF.DCs promote the proliferation and activation of HSCs not only through stimulating T cells and NK cells to secrete inflammatory cytokines,but also up-regulating the expression of ICAM-1 and CD40 on HSCs.TRAIL,NKG2D,and Fas-FasL pathways could be important for NK cells to kill activated HSCs.In addition,NK cells inhibit the activation and the proliferation of HSCs through IFN-γ and STAT1 pathway.NKT cells activate HSCs through IL-4,IL-13 as well as hedgehog and osteopontin pathways.Th1 cells inhibit fibrosis through secreting IFN-γ.Both of ILC2s and Th2 cells could promote HSCs activation via secreting IL-13.IL-17 and IL-21 of Th17 cells promote liver fibrosis,whereas IL-22 of Th17 cells could induce HSCs senescence.Anti-fibrosis effect of Tregs may achieved through IL-10 and IL-35.B cells may aggravate fibrosis through IL-6.

图1免疫细胞在纤维化进程中的作用

Fig1Thekeyrolesofimmunecellsintheprogressionofliverfibrosis