姜晓斐 罗心平 高秀芳 施海明

(复旦大学附属华山医院心内科 上海 200040)

红景天是景天科红景天属多年生草本或亚灌木植物,生长于高寒低氧地带,药理作用广泛[1],其耐缺氧、抗心肌缺血作用的机制[2-3]一直受到关注。肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)属于降钙素基因相关肽家族成员,具有促进血管扩张、内皮细胞增殖、血管新生等多种生物学效应[4-5],降钙素受体样受体(calcitonin receptor-like receptor,CRLR)是ADM的特异性受体,与之结合产生系列生物学效应。我们之前的研究[6-8]证实红景天具有促缺血心肌血管新生作用,这一作用主要存在于低氧状态下,与红景天上调ADM及CRLR的表达有关,并且作用具有一定的靶向性。缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha,HIF-1α)[9-10]是体内氧稳态的主要调节因子,在维持体内氧平衡中起着举足轻重的地位,目前已知ADM基因有多处HIF-1结合位点,CRLR基因启动子中亦含有HIF-1结合位点,HIF-1α是否是红景天对ADM系统调节作用的上游机制尚不清楚。因此我们通过低氧状态下红景天处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)观察ADM、CRLR及HIF-1α基因的表达情况,并通过siRNA技术敲低HIF-1α基因探讨红景天作用中ADM及其受体CRLR与HIF-1α之间的关系。

材 料 和 方 法

细胞培养HUVECs由中科院细胞库提供。细胞复苏后贴壁培养于含10%胎牛血清的1640培养液中,置于5% CO2、饱和湿度的37 ℃恒温培养箱中培养传代,取对数生长期细胞进行实验。

药物与药物配置大花红景天块茎购于上海雷允上大药房。红景天块茎粉碎成粉状,入中药提取罐加水加热,提取药汁、筛网过滤、真空浓缩后入真空干燥箱干燥,干燥后粉碎机粉碎制成红景天干粉(1 kg红景天块茎可制成红景天干粉211.59 g),以红景天苷单体为标准品采取高效液相色谱法测定红景天干粉中红景天苷单体的含量为0.83% (即每1 g红景天干粉中含有8.3 mg红景天苷单体);之后去离子水溶解无菌过滤制成100 μg/mL的红景天培养母液,再用含10%胎牛血清的1640培养液稀释为红景天培养液。

仪器与试剂CCK-8试剂盒(日本同仁公司);ADM抗体 、CRLR抗体、HIF-1α抗体和β-actin抗体(美国 R&D SYSTEMS公司);逆转录反应试剂盒FSQ-101、荧光定量PCR检测试剂盒QPK-212 (日本TOYOBO公司);HIF-1αsi RNA、阳性对照si RNA、阴性对照si RNA及荧光标记siRNA(上海吉玛公司)。CO2恒温培养箱、无氧培养箱(美国THERMO公司)、酶标仪ELX-800(台湾METERTECH公司)、PCR基因扩增仪5341ep(德国Eppendorf公司)、实时荧光定量PCR仪7500 (美国ABI公司)。

分组及干预将实验细胞分为正常氧对照组(NOR)、低氧对照组(HYPO)和低氧红景天组(HYPO+RHO) 3组。2个对照组使用的对照培养液为含10%胎牛血清的1640培养液,低氧红景天组使用红景天干粉配制的红景天培养液;低氧条件为1% O2、5% CO2、94% N2的低氧培养箱培养24 h。每组又根据转染条件不同分为空白对照CON(不加siRNA)组、阴性对照NEG(转染阴性对照siRNA)组、HIF-1α siRNA(转染HIF-1α siRNA)组。所有细胞实验均至少重复3次或3个复孔。

CCK8法观察不同作用时间(24～72 h)和药物浓度(1～100 μg/mL)下红景天促细胞增殖情况。酶标仪检测各孔吸光度(D)值,无红景天干预孔为对照组,无细胞仅含检测液孔为空白组,相对细胞增殖率=(实验组D值-空白组D值)/(对照组D值-空白组D值)×100%。

Westernblot法干预处理后的细胞提取总蛋白,样品蛋白通过BCA法于分光光度计检测其浓度。每样品孔上样50 μg总蛋白进行SDS-PAGE分析,半干法将蛋白转至PVDF膜上,5% BSA溶液中室温封闭1 h,分别加入相关一级抗体4 ℃过夜,TBS/T洗膜3次,加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h,TBS/T洗膜3次,加入显色液X线胶片曝光,图片扫描保存为电脑文件,用Image J 分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化,以β-actin为内参,对各组ADM、CRLR、HIF-1α蛋白表达水平进行相关分析。

Real-timePCR法Trizol法提取总RNA,凝胶管电泳系统检测RNA的完整性,28S∶18S约为2∶1,条带明显。分光光度计测量RNA纯度,D260/D280为2.0～2.1。取0.9 μg总RNA在20 μL反应体系中逆转录合成cDNA。根据GeneBank提供的基因序列使用ABI Primer Express 2.0软件设计PCR引物(由上海基星生物技术公司设计,上海生工生物工程有限公司合成)。引物序列详见表1。取2.0 μL逆转录合成的cDNA在20 μL反应体系中进行实时PCR扩增,反应程序为:95 ℃ 60 s,1个循环,然后95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s。

表1 实时定量PCR引物序列Tab 1 Sequences of PCR primers at real-time quantification

小RNA干扰技术在NCBI(美国国立生物技术信息中心)里寻找HIF-1α的mRNA 序列全长,应用Silencer TM软件设计3对用于沉默HIF-1α基因的siRNA(上海吉玛公司化学合成),使用荧光标记的siRNA(FAM-siRNA)检测转染效率、优化细胞转染条件,最后确定目标siRNA序列在siRNA、RNAi-Mate比例为3∶1,浓度为60 nmol/L时抑制作用最强,HIF-1αsiRNA目标序列及对照siRNA序列见表2。HIF-1αsiRNA转染细胞24 h后进行相关干预,干预24 h后收集细胞进行蛋白和基因检测。

表2 siRNA序列Tab 2 Sequences of siRNA

结 果

红景天促进低氧状态下HUVECs增殖我们之前的研究发现红景天具有一定的促细胞增殖作用,这一作用主要在低氧状态下存在,正常氧状态实验条件下未观察到类似的增殖作用。为了进一步分析红景天对低氧状态下HUVECs增殖的影响,用不同浓度红景天不同时间处理HUVECs后,CCK8法检测细胞增殖情况。以各时段的无药物干预组为对照组,所得相对细胞增殖率发现,低氧状态下一定剂量范围内红景天有剂量依赖性促内皮细胞增殖作用,这一作用在红景天干预24 h、红景天浓度10 μg/mL时最为显著(表3),并作为最佳干预条件用于实验研究。

红景天促进低氧状态下内皮细胞ADM及其受体CRLR的表达为分析红景天低氧状态下促细胞增生作用中对内皮细胞ADM途径的影响情况,以10 μg/mL红景天处理HUVECs 24 h后,实时定量PCR及Western blot分别测定ADM及其受体CRLR mRNA及蛋白表达的情况。低氧状态下HUVECs经红景天处理24 h后,ADM及CRLR的mRNA水平明显增加(图1B);与低氧对照组相比,ADM及CRLR的蛋白水平也同样上调(图1A),提示红景天可以上调低氧状态下内皮细胞ADM及CRLR的基因表达。

Concentration of Rhodiola rosea24 h48 h72 hNOR 0 μg/mL2.63±0.843.45±0.344.24±0.12HYPO 0 μg/mL1.54±0.272.17±0.332.53±0.05 1 μg/mL2.13±0.17(1)2.52±0.012.77±0.07 5 μg/mL2.53±0.11(1)2.90±0.15(3)2.98±0.15HYPO+RHO 10 μg/mL2.79±0.10(1) (2)2.92±0.75(3)3.35±0.28 50 μg/mL1.24±0.032.59±0.232.79±0.15 100 μg/mL0.77±0.31(1)2.05±0.212.22±0.11

(1)vs. hypoxia control group for 24 h,P<0.05;(2)vs.other RHO groups for 24 h,P<0.05;(3)vs.hypoxia control group for 48 h,P<0.05.

A:Protein expression of ADM&CRLR;B:Relative mRNA expression of ADM & CRLR.vs.hypoxia control group,(1)P<0.05,(2)P<0.01.

图1红景天对脐静脉内皮细胞ADM及CRLR基因表达的影响
Fig1TheinfluenceofRhodiolaroseaonADMandCRLRgeneexpressioninHUVECs

红景天促进低氧状态下内皮细胞HIF-1α的表达为分析红景天低氧状态下促细胞增殖作用中对内皮细胞HIF-1α表达的影响,同样条件下红景天干预后测定HIF-1α mRNA和蛋白质水平表达的情况。与低氧对照组比较,红景天干预后脐静脉内皮细胞HIF-1α mRNA(图2B)和蛋白质水平(图2A)均明显增加,证实红景天可以上调低氧状态下内皮细胞HIF-1α基因的表达。

(1)vs.Hypoxia control group,P<0.05.

图2红景天对脐静脉内皮细胞HIF-1α基因表达的影响
Fig2TheinfluenceofRhodiolaroseaonHIF-1αgeneexpressioninHUVECs

HIF-1α介导红景天的促ADM/CRLR表达作用以上实验结果证明红景天可以促进低氧状态下HIF-1α以及ADM及其受体CRLR基因的表达,已知HIF-1α是体内氧稳态的主要调节因子,ADM及CRLR基因都含有HIF-1的结合位点。为验证红景天是否通过HIF-1α介导产生促ADM及CRLR表达的作用,我们用HIF-1αsiRNA转染HUVECs培养24 h后,实时定量PCR检测HIF-1α的抑制效率为85%。在此基础上,我们观察红景天干预后ADM及其受体CRLR基因表达的变化,结果提示,与空白对照组(CON)及阴性对照siRNA (NEG)对照组比较,转染HIF-1αsiRNA各组内皮细胞ADM及其受体CRLR mRNA(图3)和蛋白(图4)表达均受到明显抑制,红景天组与单纯低氧组ADM及CRLR表达无明显差异,HIF-1α siRNA显著抑制了红景天对ADM及CRLR表达的促进作用,提示红景天的促ADM/CRLR表达作用确实由HIF-1α介导。

(1)vs.Hypoxia control group,P<0.05.

图3HIF-1αsiRNA处理后各组细胞ADM、CRLR、HIF-1αmRNA的相对表达量
Fig3TheexpressionofADM,CRLRandHIF-1αmRNAinHUVECsafterHIF-1αknockdown

讨 论

冠心病是严重影响人类健康的一类常见病和多发病,冠心病的治疗手段虽然已经有了长足的发展,但还有一部分患者药物治疗效果欠佳又不适宜进行介入治疗或手术后发生再狭窄,治疗性血管新生[11-12]可能能够改善这部分患者的预后。

红景天是主要生长于高寒低氧地区的一种药用植物,具有抗疲劳、抗缺氧、抗辐射、心血管保护等多种药理作用,我们一直在研究其促血管生长、促内皮细胞增殖、抗心肌缺血作用的机制[6-8,13-14]。我们前期的研究观察到与同等条件低氧状态下比较,正常氧状态下红景天无明显的促细胞增殖作用,以往的研究[15]甚至发现正常氧状态下红景天具有抑制HUVECs生长的作用。本次研究验证了一定范围内低氧状态下红景天有剂量依赖性促细胞增殖作用,这些研究结果提示红景天的促细胞增殖作用具有一定的低氧特异性,这一过程是否与低氧状态下低氧相关的细胞因子(HIF1α)对促细胞增殖相关因子(ADM/CRLR)的调节有关？我们针对这一问题进行了进一步研究。

(1)vs.Hypoxia control group,P<0.05.

图4HIF-1αsiRNA处理后各组细胞ADM、CRLR、HIF-1α的蛋白质表达
Fig4TheexpressionofADM,CRLRandHIF-1αproteinsinHUVECsafterHIF-1αknockdown

ADM是1993年由Kitamura等[4,16]从人类嗜铬细胞瘤组织中提取的一种生物活性肽,属于降钙素基因相关肽家族成员,ADM通过与CRLR联合作用发挥其多种生理效应,在缺血性心脏病、缺血再灌注损伤等方面进行的多项科学研究显示,通过ADM治疗诱导血管新生可获益。我们的研究发现红景天可以明显上调缺血心肌ADM及其受体CRLR的表达,并且这一作用具有靶向性。ADM在体内分布广泛,其中循环的ADM主要来源于血管内皮细胞,我们用红景天处理低氧状态下的HUVECs,发现ADM及其受体CRLR的mRNA和蛋白表达都明显升高,说明红景天可以上调ADM和CRLR基因的表达,这一作用是否有其共同上游作用机制,其机制是否与低氧诱导因子相关,我们就此进行了进一步研究。

HIF-1是调节体内氧稳态的主要转录因子,其中HIF-1α尤为重要,多种HIF-1的目的基因所编码的蛋白被确认在血管新生的过程中起到关键的作用。目前的研究表明ADM及其受体CRLR基因启动子中都含有HIF-1结合位点(hypoxia response element,HRE),ADM的促血管新生作用可能主要在HIF-1的作用下通过多种信号转导通路实现,为了验证红景天在低氧状态下促ADM/CRLR分泌作用也是HIF-1α介导的,我们用siRNA技术敲除HIF-1α基因,结果发现红景天上调低氧状态下内皮细胞ADM及CRLR表达的作用被明显抑制,证实低氧状态下红景天对肾上腺髓质素系统的上调作用是HIF-1α依赖的。这一结果提示HIF-1可能是红景天抗缺血缺氧促血管新生作用的核心靶点,其作用表现为上调HIF-1α基因的表达,进而与包括ADM、CRLR、VEGF等多种促血管新生因子/受体基因启动子的HRE结合,上调ADM、CRLR、VEGF等基因的表达,最终产生抗缺氧促血管新生的作用。

我们的研究证实低氧状态下红景天通过上调HIF-1α促进HUVECs ADM及其受体CRLR的表达,提示HIF-1可能是红景天抗缺血缺氧促血管新生作用的核心靶点。HIF是否是低氧状态下红景天作用的唯一靶点,阻断HIF-1α是否红景天的促细胞增殖作用完全消失,正常氧状态下红景天无明显促细胞增殖作用,正常氧状态下红景天对HIF-1α、ADM、CRLR等细胞因子是否不产生影响,这些问题需在进一步的实验研究中发现与证实。