薛汝群 杨 望 张 敏 赵仲华 刘学光△

(1复旦大学基础医学院病理学系 上海 200032; 2复旦大学临床医学院 上海 200032)

肾小球壁层上皮细胞(parietal epithelial cells,PECs)是内衬于鲍曼氏囊的一层扁平上皮,与足细胞一样均来源于后肾间充质干细胞[1],且两者解剖位置毗邻。足细胞位于肾小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)外侧,构成肾小球滤过膜的最外层,可阻止白蛋白进入原尿。足细胞受损从GBM脱落后,PECs被活化,活化的PECs(activated PECs,aPECs)胞体增大,发生增生、迁移、分泌细胞外基质等生物学行为。多数aPECs黏附于裸露的GBM外侧以代偿丢失的足细胞,少数aPECs增生形成假新月体[2],进而导致肾小球发生粘连、节段性硬化甚至球性硬化,这是导致蛋白尿及肾小球硬化发生发展的中心事件[2-5]。足细胞属高度分化的终末细胞,自身无法增殖。因此,寻找能够分化为足细胞从而补充丢失足细胞、促进疾病修复的前体细胞(progenitor cells)或干细胞,已成为肾脏研究领域的重点内容[5-7]。近年有研究显示,在以足细胞损伤为特征的肾病动物模型和人肾小球疾病患者中,PECs可共表达足细胞特异性标志蛋白,因此PECs已成为备受关注的具备足细胞分化潜能的前体细胞[4-7]。

肾上腺髓质肽(adrenomedullin,AM)是一种小分子血管活性肽,与受体结合后激活腺苷酸环化酶-蛋白激酶A信号通路,发挥多种生物学功能[8]。AM在肾脏中广泛表达于肾小球系膜细胞、足细胞、肾小管上皮细胞以及血管壁等。我们前期的研究发现,AM可保护受损的足细胞并促进足细胞损伤动物模型的修复[9]。AM是否通过调控PECs分化促进其肾脏保护作用,目前尚未见报道。

Notch信号通路在调控PECs向足细胞的分化中发挥重要作用。Notch信号通路分布广泛、高度保守,通过相邻细胞之间的相互作用调控前体细胞或干细胞的分化。哺乳动物细胞有4个跨膜受体(Notch1/2/3/4)和5个跨膜配体(Dll-1/3/4和Jagged-1/2)。配体与受体结合后激活该信号通路,Notch胞内功能域(NICC)被γ分泌酶水解并向核内转位,从而促进下游靶基因(如Hes、Hey等)的转录[10]。体外研究显示,持续下调Notch可抑制hPECs增生并获得足细胞表型[11-12]。体内研究发现,在阿霉素所致局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)小鼠模型、狼疮性肾炎及FSGS患者中,PECs高表达Notch3/Hes1且伴有明显增生[12]。

嘌呤霉素氨基核苷(puromycinaminonucleoside,PAN)是一种来源于链霉菌属细菌的氨基核苷类抗生素,可导致溶酶体质翻译过程中发生过早的肽链终止而造成细胞损伤,是通过造成足细胞损伤而建立肾病综合征动物模型的常用药物之一[13]。本研究拟建立大鼠PAN肾病模型并应用AM进行治疗,分别在不同时间点观察AM对PECs分化的调控作用以及Notch信号通路的改变,探讨AM在足细胞损伤性肾脏疾病中对PECs分化的调控作用及其分子机制。

材 料 和 方 法

大鼠PAN足细胞损伤模型的建立雄性SD大鼠(上海SLAC实验动物公司),体重130～150 g,随机分为3组:对照组、模型组和治疗组(每组n=5)。模型组和治疗组大鼠均一次性腹腔注射PAN(美国Sigma公司) 15 mg/100 g体重,对照组经腹腔注射等体积无菌生理盐水;治疗组大鼠每天经尾静脉注射AM 蛋白质(苏州强耀生物科技有限公司)6.6μg/100 g体重,对照组及模型组每天经尾静脉注射等体积无菌生理盐水。动物处死前收集24 h尿液。分别于首次注射PAN后第7 、14 及21 天处死动物,获取肾脏组织待用。

所有动物置于恒温[(21±2)℃]、恒湿(40%～60%)、12 h光照的环境中饲养,正常进食、饮水。动物实验方法依照《上海市医学实验动物管理委员会标准》和《复旦大学实验动物使用及护理指南》要求进行。

尿蛋白SDS-PAGE将24 h尿液离心,取上清,以8%分离胶进行SDS-PAGE,考马斯亮蓝(R250)染色,行光密度分析。

肾组织PAS染色及形态学分析对肾脏组织石蜡切片行常规PAS染色。光镜下观察肾组织形态学改变,对肾小球损伤程度行半定量分析。肾小球损伤常表现为足细胞肿大伴胞质内蛋白质吸收滴、节段性粘连、系膜基质节段性增多(节段性硬化)及局限性PECs增生。在中倍镜视野下随机选取100个肾小球,计算受损肾小球并进行统计学分析。

免疫组化染色肾脏石蜡切片常规二甲苯脱蜡、梯度酒精入水,3% H2O2溶液去除内源性过氧化物酶,柠檬酸缓冲液微波抗原修复(900 W、2.5 min,150 W、15 min),正常血清封闭非特异性结合位点,羊抗synaptopodin (sc-21537)、兔抗p57(sc-8298) 4 ℃孵育过夜,HRP-IgG孵育45 min,DAB显色,苏木精衬染细胞核,中性树胶封片。p57阳性染色定位于足细胞的细胞核,应用Image-Pro Plus软件定量分析p57阳性细胞计数,每只实验动物平均采集30个肾小球。

双重及三重免疫荧光染色选取claudin-1为PECs特异性标记蛋白,WT1及synaptopodin为足细胞特异性标志蛋白。应用OpalTM4-Color Fluorescent IHC试剂盒(美国Perkin Elmer公司)对肾脏石蜡切片分别行双重或三重免疫荧光染色,包括AM/claudin-1、Ki67/claudin-1、Ki67/WT-1、claudin-1/WT1、claudin-1/synaptopodin、Notch3/claudin-1及Notch3/claudin-1/synaptopodin。该试剂盒采用酪胺信号放大技术(TSATMTyramide Signal Amplification),在H2O2存在时,酪胺被二抗固定的HRP迅速激活,随后与含有大量酪氨酸结合位点的相接蛋白(如HRP、抗体、目标抗原)共价结合,信号被有效放大。石蜡切片常规脱蜡,3%H2O2去除内源性过氧化物酶,封闭液封闭非特异性结合位点,第一重一抗4 ℃孵育过夜,HRP-二抗孵育10 min,TSA染色孵育10 min;微波处理去除第一重一抗及二抗,封闭,加第二重一抗,方法同上。DAPI衬染细胞核,甘油封片。应用Vectra 光谱成像系统对切片进行图片扫描,Inform软件分析肾小球中PECs及足细胞特异性标志蛋白双重染色阳性细胞的定量统计。所用一抗包括:兔抗AM(sc-33187)、鼠抗WT-1(sc-7385)、羊抗synaptopodin(sc-21537)(美国Santa Cruz公司),兔抗claudin-1(51-9000)(美国Thermo Fisher公司),兔抗Notch3(ab23426)、兔抗Ki67(ab16667)(英国Abcam公司)。

结 果

AM显著降低PAN肾病大鼠的尿蛋白水平与对照组相比,模型组尿蛋白于7、14和21天均显著升高,其中14天达峰值。与模型组相比,治疗组尿蛋白水平显著降低。尿蛋白成分均以白蛋白为主(图1)。

AM显著改善PAN肾病大鼠的肾组织形态模型组于7和14 天均可见肾小球足细胞肿胀伴胞质内蛋白质吸收颗粒形成,部分肾小球可见毛细血管袢与球囊壁节段性粘连、系膜基质节段性增多,于21天可见节段性硬化及PECs局限性增生。与模型组相比,治疗组的肾小球损伤明显减轻,形态学半定量分析显示差异有统计学意义(图2)。

AM显著增加大鼠PAN肾病的足细胞计数选取足细胞特异性标志蛋白p57进行足细胞计数。与对照组相比,模型组P57计数于7、14和21天均显著减少,减少比例分别为41.50%、43.29%和25.59%,并于14天达最低值,21天有所恢复。与模型组相比,治疗组p57计数显著增高(图3)。

图1AM显著降低大鼠PAN肾病的尿蛋白水平
Fig1AMsignificantlyamelioratedalbuminuriainPANnephrosisrats

图2AM显著改善大鼠PAN肾病的肾组织形态学
Fig2AMmitigatedglomerularmorphologicchangesinPANnephrosisrats

大鼠PAN肾病PECs中AM表达上调选取claudin-1作为PECs特异性标志蛋白。在对照组中,AM呈弱阳性定位于肾小球毛细血管袢内,未见AM/claudin-1双重染色阳性细胞。模型组于7、14和21天时见双重染色阳性细胞主要沿鲍曼氏囊分布,14和21天可见部分双重染色阳性细胞出现于毛细血管袢内。与模型组相比,14和21天时治疗组双重染色阳性的细胞计数显著增加(图4)。

图3AM显著增加大鼠PAN肾病的足细胞计数
Fig3AMincreasedpodocytenumberinPANnephrosisrats

AM促进PECs分化对照组未见claudin-1/WT-1或claudin-1/synaptopodin双重染色阳性细胞。模型组于7 天见少数双重染色阳性细胞沿鲍曼氏囊分布,偶见分布于毛细血管袢边缘;14和21天双重染色阳性细胞数逐渐增多且部分位于毛细血管袢内。与模型组相比,治疗组14天的claudin-1/WT-1或claudin-1/synaptoppodin双重染色阳性细胞计数显著增多(图5)。

图4大鼠PAN肾病的肾小球中AM表达上调
Fig4UpregulationofAMinglomeruliofPANnephrosisrats

A subset of PECs coexpress the PECs specific marker claudin-1 and the podocyte markers WT-1 (A,×400) or synaptopodin (B,×400) in PAN nephrosis rats.On day 14,AM markedly increases both claudin-1+/WT-1+and claudin-1+/synaptopodin+cells,which are located not only along Bowman’s capsule but also in the glomerular tuft (C and D).(1)P<0.01.

图5AM促进大鼠PAN肾病中PECs向足细胞分化
Fig5AMpromotesthedifferentiationofPECsintopodocytesinPANnephrosisrats

PECs表达细胞增殖抗原Ki67对照组肾小球未见Ki67阳性表达。经PAN处理,肾小球内均见Ki67阳性表达,Ki67与WT-1无共定位表达(图6A),但与claudin-1共定位表达(图6B)。Ki67/claudin-1双重染色阳性细胞仅沿鲍曼氏囊分布(图6 B);与模型组相比,治疗组双重染色阳性细胞计数无明显差异。

A:PECs proliferation was measured by double immunofluorescence staining for Ki67 (green) and claudin-1 (red),while Ki67+/WT-1+cells were not found in glomeruli (×400).B:Ki67+/claudin-1+cells were exclusively found along Bowman’s capsule (×400).

图6大鼠PAN肾病中PECs表达细胞增殖核抗原Ki67
Fig6PECsexpressedproliferationnuclearantigenKi-67inPANnephrosisrats

AM抑制肾小球Notch3表达对照组肾小球Notch3染色阴性。经PAN处理后,肾小球Notch3表达显著升高,分别沿鲍曼氏囊及在毛细血管袢内分布,14 天仍维持较高水平的表达,21 天表达有所下调(图7A)。claudin-1/synaptopodin/Notch3三重免疫荧光染色显示,Notch3分别与claudin-1、synaptopodin共定位表达于PECs、足细胞(图7B)。Notch3/claudin-1双重染色阳性细胞主要沿鲍曼氏囊分布,14和21 天部分出现于毛细血管袢内。与模型组相比,治疗组中PECs及足细胞的Notch3表达均显著下调,Notch3/claudin-1双重染色阳性细胞计数显著减少。

讨 论

当足细胞遭受较大或持续损伤时从GBM脱落、丢失。足细胞数量的减少与恢复程度直接关系到肾小球结构变化。Shankland等[5]认为,足细胞丢失超过20%可导致肾小球毛细血管袢发生节段性粘连乃至FSGS;若其数量恢复至20%或以上,则可阻止或逆转硬化的发生。我们通过一次性腹腔注射PAN建立大鼠足细胞损伤模型,经p57免疫组化染色发现,模型组的足细胞计数显著下降,其中足细胞丢失超过40%,光镜检查见肾小球毛细血管袢节段性粘连、节段性基质增多、尿蛋白水平显著升高且以高选择性白蛋白尿为主,因此该大鼠PAN足细胞损伤模型与人FSGS病变相似[14]。

AM已被证实具有肾脏保护作用[8],包括多种肾损伤模型(如大鼠Thy1.1系膜增生性肾炎模型[15]、大鼠缺血/再灌注损伤模型[16]及单侧输尿管结扎模型[17]等)和多种人类肾脏疾病(如IgA肾病[18]、糖尿病肾病[19]等)。我们在前期研究中发现,PAN能显著升高足细胞的AM表达[9]。本研究中,大鼠经PAN处理后,不仅肾小球毛细血管袢内的AM表达显著升高,而且AM/claudin-1双重免疫染色显示PECs的AM表达亦显著升高。结果提示,在PAN足细胞损伤模型中,足细胞及PECs中AM表达上调反映了机体的一种代偿性保护机制。经AM治疗后,大鼠的尿蛋白及肾组织形态均有显著改善,证实AM可对大鼠PAN足细胞损伤模型发挥一定的保护作用,与前期研究结果一致[9]。

Double immunofluorescence for Notch3 (green) and claudin-1 (red) (A) or triple immunofluorescence for Notch3 (pink),claudin-1 (red) and synaptopodin (green) (B) show the upregulation of Notch3 in both PECs and podocytes,which is inhibited by AM administration in PAN nephrosis rats.

图7AM抑制大鼠PAN肾病中肾小球Notch3表达
Fig7AMinhibitstheupregulationofNotch3inglomeruliofPANnephrosisrats

近年来,通过行PECs特异性标记蛋白和足细胞特异性标记蛋白的双重免疫染色、或者应用经基因特异性标记PECs或者足细胞并进行细胞谱系跟踪观察,发现PECs可共表达足细胞特异性标志蛋白(包括P57、WT-1、synaptopodin、podocalyxin、nephrin等)[1,4-7]。Ronconi等[20]及Appel 等[4]分别在正常人肾脏及幼年小鼠肾脏中发现内衬于鲍曼氏囊的PECs表达干细胞标志物CD133/CD24;将位于肾小球尿极端的PECs亚群分离并注射入阿霉素性小鼠FSGS模型体内,能够显著减轻尿蛋白水平并改善肾组织损伤。Ohse等[21]在TGF-β1转基因小鼠模型、阿霉素所致FSGS小鼠模型、抗GBM病(1型CreGN)小鼠模型中发现,分布于肾小球毛细血管袢内的呈双重染色阳性的细胞数量显著增多。Eng等[22]应用永久标记PECs的成年PEC-rtTA/LC1/R26报告基因小鼠构建的FSGS模型发现,随着病程进展,位于毛细血管袢内的PECs数量呈进行性增多,在疾病早期(7和14天)表达活化标志物CD44,在疾病恢复期(28天)则共表达足细胞标志蛋白,且伴随足细胞计数显著增加、尿蛋白和肾组织形态的明显改善。当分别应用血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)[23]或维甲酸[24]治疗CreGN动物模型、应用ACEI[25]或激素[26]治疗FSGS小鼠模型及改善DN动物模型的糖代谢[27-28]时,肾小球内共表达PECs/足细胞特异性标志蛋白的细胞数量显著增多,同时伴有蛋白尿、肾功能及肾组织形态的显著改善,而足细胞不表达细胞增殖标志物(如Ki67、BrdU掺入法)。α/β-干扰素抑制体外培养hPECs向足细胞的分化,且加重阿霉素所致FSGS小鼠的肾小球炎症和蛋白尿水平[29]。

本研究在正常大鼠中未发现共表达PECs及足细胞特异性标志蛋白的细胞(WT-1/claudin-1以及synaptopodin/claudin-1双重免疫染色)。大鼠经PAN处理后,损伤早期(7天)开始出现少量双重染色阳性细胞且主要沿鲍曼氏囊分布;随着病程进展,上述双重染色阳性细胞显著增加且出现于毛细血管袢内,伴修复期(21天)动物蛋白尿部分缓解伴足细胞计数改善。AM治疗在14天可进一步增加肾小球内双重染色阳性细胞,且显著改善足细胞计数、尿蛋白水平和肾组织形态。细胞增殖标志物Ki67仅表达于PECs而非足细胞,提示足细胞数量的恢复可能部分由增生的PECs分化而来。因此,当足细胞大量丢失时,AM可能促进PECs向足细胞分化,以补充受损足细胞,从而促进疾病的修复。

Notch信号通路不仅参与肾脏的发生,而且参与调控成体肾脏中PECs向足细胞的分化。在肾脏发生过程中,S形小体的PECs表达Notch1/2及其下游转录因子Hes1/Hey1,但在其终末分化过程中表达下调;当处于分化过程中或分化成熟的足细胞中Notch信号通路被激活时,肾小球病变分别表现为弥漫性系膜硬化或FSGS[10]。体外研究显示,持续活化Notch信号通路可促使PECs增生、上皮间质转化,抑制Notch信号通路则促使PECs获得足细胞表型;当足细胞的Notch发生活化时,则导致其发生有丝分裂灾难(mitotic catastrophe)而死亡[11-12]。在阿霉素所致小鼠FSGS模型中,PECs和足细胞的Notch3表达均显著上调;若应用γ分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch通路,在损伤期虽可改善蛋白尿、减少足细胞丢失,但在恢复期则因降低PECs增生而加重蛋白尿及肾小球硬化[14]。在本研究中,正常大鼠肾小球不表达Notch3,PAN造成足细胞损伤后,Notch3/claudin-1/synaptopodin三重免疫荧光染色显示PECs和足细胞中Notch3表达均显著上调,提示PAN造成足细胞损伤及PECs活性改变。经AM治疗后,足细胞及PECs中Notch3表达均显著下调,迁移至肾小球毛细血管袢内表达Notch3的PECs显著减少,但出现在毛细血管袢内的高表达AM的PECs显著增多,且共表达足细胞标志蛋白的PECs亦显著增多。结果提示,AM可能通过下调Notch3信号通路,分别发挥促进PECs分化以及对足细胞的直接保护作用。

Notch信号通路由数个不同的受体和配体组成,它们在不同细胞、组织中表达不同,且处在同一微环境中的足细胞、PECs之间存在信号分子的相互串话(cross-talk)[30]。对上述领域的研究有助于深入探索AM对Notch信号通路的调控作用,以期为其促进以足细胞损伤为主的肾脏疾病的修复提供更多的理论和实践依据。