张 浩，郭虹彩，马文奎，曹金元

（北京农业职业学院，北京 102442）

目前，动物细菌性疾病十分普遍，严重危害我国畜牧业的发展。在基层疾病诊疗过程中，大量使用抗菌药物的情况极其普遍，导致细菌耐药性不断增强，甚至个别养殖户在饲料中添加多种抗菌药以减少疾病的发生。由于长期滥用抗生素致使细菌产生耐药性，造成养殖成本增加，畜产品存在药物残留，严重影响养殖户的经济效益，同时危及人类的健康。在治疗畜禽疾病时，通过药敏试验判断抗生素药物对病原微生物抑菌效果，从而在最短的时间内找出最有效的抗菌药物，解决生产实践中的实际问题，在临床上可以防止滥用抗生素［1］。为了节约药敏试验成本，该试验选取常用的抗菌药物，按照不同的浓度梯度制成药敏纸片来检测大肠杆菌对药物的敏感度，并与市场上销售的药敏纸片进行对比，从而建立一种简单快速制备药敏纸片的方法，有效地指导兽医临床用药。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 抗菌药物：试验选取兽医临床上常用的青霉素G、卡那霉素、庆大霉素、氧氟沙星、链霉素、头孢噻呋钠6种抗菌药物。

1.1.2 培养基：选择营养琼脂培养基 （批号：20180305）、营养肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基（批号：20180420）3 种培养基用于大肠杆菌［2］药敏测试。培养基均购于北京天坛生物制品股份有限公司，其制备按厂家提供的说明方法进行。

1.1.3 试验菌种：大肠杆菌菌株采购于中国兽药监察所。

1.1.4 试验器材：数显电热培养箱 （HPX-9272MBE，上海博迅实业有限公司）、超净工作台（VS-1300L-U，苏州安泰）、电子天平（FA2204B，上海佑科仪器仪表有限公司）、微量移液器、手提式不锈钢蒸汽消毒器（YXQ-LS-18SI，上海博迅实业有限公司）、海尔冰箱（BCD-322WCKGN33A2S0C）、90 mm培养皿、滤纸、涂布器、不锈钢打孔器。

1.2 方法

1.2.1 抗菌药物的配制：按照厂家推荐药物治疗量［3］，制备治疗量（标记 1×）、2 倍治疗量（标记 2×）和4倍治疗量（标记4×）的抗菌药物原液，过滤除菌后置-20℃保存备用。

1.2.2 纸片的制备：利用打孔器将110 mm的定性滤纸打成直径为6 mm［4］的圆形小纸片，放入清洁干燥的青霉素空瓶中，每瓶放入50片，用牛皮纸包好瓶口并用小线扎紧，高压灭菌（121℃，15 min），烘干，密封备用。

1.2.3 磷酸缓冲盐溶液（PBS）配制：作为溶剂起溶解、保护药品的作用，参照《培养细胞学与细胞培养技术》［5］配制 PBS。

1.2.4 药敏纸片的制备：在无菌条件下（超净工作台要求的环境），分别吸取不同浓度的药液0.5 mL加入装有纸片的青霉素瓶中，用牛皮纸密封瓶口，浸泡1 h，让药液被纸片充分吸净；然后将纸片散开放入灭菌的培养皿中，无菌室搁置过夜，待纸片完全干燥后，收集在青霉素瓶内，密封，贴好标签，置于-20℃保存备用。

1.2.5 自制药敏纸片与市售药敏纸片抑菌效果观察：利用超净工作台的工作环境，用接种环挑取大肠杆菌接种于肉汤培养基中，37℃培养24 h后取出，轻轻振荡使菌液均匀、混浊；用微量移液器吸取0.5 mL，注入做好的营养琼脂培养基中，然后用涂布器将菌液均匀推开；待菌液被培养基吸收后用灭菌镊子将制备好的药敏纸片贴在培养皿内，每个培养皿内贴5个不同的纸片（中间1片，周围4片）。同时，按上述方法将从市场上购买来的标准药敏纸片也贴于涂有大肠杆菌的培养皿中做对比。将培养皿放入电热恒温培养箱内，37℃培养24 h后取出，用直尺测量抑菌圈直径，测量3次取其平均值，记录数据。

1.2.6 判定标准：根据抑菌圈直径大小作为判断药物敏感程度标准，抑菌圈直径越大说明细菌对该药物的敏感性越高［6］。各种抗菌药物的判断标准［7］见表 1。

表1 不同抗菌药物抑菌效果判定标准

2 结果与分析

不同浓度抗菌药物的自制药敏纸片和市售药敏纸片对大肠杆菌的抑菌效果［8］见表2。由表2可知，3个不同浓度的青霉素自制药敏纸片与市售药敏纸片对大肠杆菌的抑菌圈直径均为0，青霉素自制药敏纸片与市售药敏纸片抑菌效果一致；2倍治疗量、4倍治疗量的卡那霉素自制药敏纸片对大肠杆菌的抑菌圈直径均为18 mm （敏感），市售卡那霉素药敏纸片对大肠杆菌的抑菌圈直径为21 mm（敏感），2倍治疗量、4倍治疗量的卡那霉素自制药敏片与市售药敏纸片抑菌效果一致；3个不同浓度的庆大霉素自制药敏纸片对大肠杆菌的抑菌圈直径均大于15 mm（敏感），市售庆大霉素药敏纸片对大肠杆菌的抑菌圈直径为15 mm（敏感），庆大霉素自制药敏片与市售药敏纸片抑菌效果一致；3个不同浓度的氧氟沙星自制药敏纸片与市售药敏纸片对大肠杆菌的抑菌圈直径均小于12 mm（耐药），氧氟沙星自制药敏纸片与市售药敏纸片抑菌效果一致。3个不同浓度的链霉素自制药敏纸片与市售药敏纸片对大肠杆菌的抑菌圈直径均小于11 mm（耐药），链霉素自制药敏纸片与市售药敏纸片抑菌效果一致；3个不同浓度的头孢噻呋钠自制药敏纸片对大肠杆菌的抑菌圈直径均小于14 mm（耐药），而头孢噻呋钠市售药敏纸片对大肠杆菌的抑菌圈直径均为16 mm（中度敏感），头孢噻呋钠自制药敏纸片与市售药敏纸片抑菌效果不一致。

表2 抗菌药物对大肠杆菌的抑菌效果

由以上结果可以得出，该试验自制的药敏纸片是成功的。

3 讨论

①由试验结果可以看出，部分自制药敏纸片测量的抑菌圈直径明显小于市售的药敏纸片，原因可能是自制药敏纸片所含药液浓度过低、涂菌不均匀或涂菌过厚所致［9］。目前市场上销售劣质兽药的现象比较严重，有些药物浓度达不到国家规定的标准，药液浓度低，自然抑菌效果就差。

②药敏试验中菌液浓度的控制很重要。通过试验，观察到同样的操作方法，若每次涂布的细菌没有经过比浊管比对［1］，它所产生的抑菌圈直径会有差异，影响药敏结果的准确性。

③由于部分药物临床上用量较少，称量时容易造成结果出现误差。该试验在称量该类药品时先扩大药量，然后进行倍数稀释，以减少误差。

④药敏纸片和药液制备过程中，要做到细致认真，只有这样才能保证试验结果尽可能精确。制备好的药敏纸片置入青霉素瓶中，高压灭菌后存放-20℃保存备用，用毕及时放回，通常可以保存2年。避免反复冻融药敏纸片，从而减少试验结果的误差。