王安平，关玮琨，李春林，伍 钢，刘 犇

（宜春学院生命科学与资源环境学院，江西 宜春 336000）

布鲁菌病（简称布病）是由布鲁菌引起的一种 人和多种动物感染的全球性疾病，其发病特征以流产和发热为主，在家畜中以牛、羊、猪感染该病最为常见，由于其可以传染给其他家畜和人，所以有效预防该病在公共卫生方面有重要意义［1］。该病的特征为隐性感染，只有在母畜怀孕时才表现为流产，从而影响动物的生产性能，给养殖户造成重大的经济损失。1955年布病作为一种人畜共患病在我国被法定公告，人类可以通过直接接触受感染的动物或食用未经充分灭菌的动物产品而被感染，在1955—2014年，共有513 034例布鲁菌病病例，其中华北地区报告了99.3%，受影响地区从北方牧区向邻近草原、农业区、南部沿海、西南地区扩展［2］。我国大部分省、市、自治区都发现布病，其中主要以内蒙古、东北、西北牧区的牛、羊布病流行严重［3］。由于布病的临床症状不明显，所以布病的检测需要结合细菌学和血清学诊断方法才能确诊。虽然近年来出现不少新的方法用来检测布病，如聚合酶链式反应（PCR）、DNA探针等，但由于检测成本高昂，操作要求严格，大型仪器不方便搬运等劣势限制了其在现场的应用，所以虎红平板凝聚试验、试管凝集试验及补体结合试验依然是布病普查的主 要方法［3］。

该研究为掌握江西省宜春市某肉牛场布病感染状况，防止工作人员感染，维护公共卫生安全，对该肉牛场进行布鲁菌病检测。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

虎红平板凝集试验抗原、布鲁菌病标准阳性血清、布鲁菌病标准阴性血清、布鲁菌病试管凝集试验抗原、稀释液等均购自中国兽医药品监察所，灭菌生理盐水和无水乙醇由宜春学院临床兽医学实验室提供。

1.2 主要耗材及设备

主要有20号针头、一次性使用真空采血管、灭菌试管、试管架、移液枪及枪头、离心机和高压灭菌锅等。

1.3 血清的制备

用缰绳保定好牛后，将牛头固定进行颈静脉采血：用碘酊和酒精消毒后按压颈静脉使其怒张，用20号针头以飞针法快速扎入，采血管稍倾斜接血；接血后标记上相应的耳标号，静置20 min后3 000 r/min离心5 min，将上清液小心吸入离心管中，-20℃保存待检。在该过程中一定要做好个人的防护工作。

1.4 虎红平板凝集试验（RPBT）

将玻璃板清洗干净，用黑色记号笔划分为等面积的36个方格，每个方格左上角写上相应的耳标号。从-20℃冰箱内取出血清，先置于4℃冷藏处解冻3 h，再取出恢复至室温待检。在每个方格中央滴加0.03 mL虎红平板凝集试验抗原，然后按相应的耳标号滴加0.03 mL受检血清，使血清和抗原混合均匀、散开、呈较大的圆形，4 min后观察结果。同时在洁净的载玻片上设置阴性、阳性对照组以及空白对照组，分别取布鲁菌病阴性血清、阳性血清和灭菌生理盐水各0.03 mL滴加于玻片上，再分别加入等量虎红平板凝集抗原充分混匀，4 min后观察结果。阳性血清对照反应时间过后出现凝集颗粒，呈点状或线状，颜色为淡红色、粉红色，界限分明（如图1a所示）；阴性血清对照表现为无凝集颗粒，呈粉红色、均匀透明，如图1b所示。参照阴、阳性血清对照组对受检血清进行判断，受检血清在4 min内出现肉眼可见颗粒状或丝状颗粒凝集现象，判为阳性；呈均匀粉红色、无凝集颗粒现象，判为阴性［4］；出现微量的凝集颗粒，或颜色分布不均匀且边缘出现凝集现象，判为假阳性，需要重新测定。

图1 虎红平板凝集试验

图2 试管凝集试验

1.5 试管凝集试验（SAT）

首先按说明书进行比浊管的制备，具体制备体系如表1所示。制备后的比浊管呈现出不同程度的浑浊度，如图2a所示。每组血清排列5个试管标明编号， 分别对应 1∶12.5、1∶25、1∶50、1∶100、1∶200倍稀释。在每组第1个试管中滴加1.15 mL稀释液，其他4个试管加入 0.5 mL稀释液；在每组第1个试管中滴加被检血清0.1 mL，混合均匀后吸取0.5 mL到下一个试管，依次进行倍比稀释，最后一个试管和第一个试管分别弃去0.5 mL和0.25 mL的混合液；5支试管调配好后各管液面高度几乎一致，若液面相差过大则应重新配制。5支试管均加入0.5 mL 1∶20倍稀释抗原，放入37℃温箱中反应22 h后取出，室温下静置2 h进行结果的判读与记录。结果的判读标准如下：菌体完全凝集，上层液体100%清亮相当于0悬液，记为++++；菌体基本完全凝集，上层液体清亮度为75%，记为+++；菌体凝集显著，上层液体清亮度为50%，记为++；弱阳性表现为有凝集物沉淀，液体清亮度25%，记为+；阴性表现为试管内液体无沉淀物，表现为均一性浑浊液体，清亮度为0，相当于100%悬液，记为-。牛的待测血清在1∶100稀释度四号管出现“++”以上凝集现象时，可判定为阳性；若在1∶50稀释度三号管出现“++”以上凝集现象时，为可疑。将可疑血清待3～4周后复检，假如结果仍为可疑，则可判定为阳性［4］。

表1 比浊对照管的配制

2 结果

2.1 虎红平板凝集试验结果

经过虎红平板凝集试验，在60份牛血清（见图1c）中，检出50份阴性血清，10份为可疑血清，阳性可疑率达到16.7%。

2.2 试管凝集试验结果

通过虎红平板凝聚试验测出10个可疑血清样本。为了进一步判定结果，进行布病试管凝集试验。在10份牛可疑血清中，经试管凝集试验，显示10份都为阴性（见图2e、f）。该次调查中布鲁菌病阴性符合数为60头，阴性符合率100%（60/60），初步判定该牛场布病的感染率为0。

3 讨论

在采血过程中要注意自身的安全防护，组员要分工明确。采血时间应在早晨饲喂前或停食（但要保证充足的饮水）后6 h进行，以免出现血清浑浊问题［5］。采血进针前一定要对进针部位进行消毒，保证不溶血、无污染、无腐败。采血时，一定要注意自身安全和防护，因为布病可以经皮肤黏膜接触感染，所以操作人员要穿防护衣、戴手套，如有破损应立即更换。避免皮肤黏膜与牛直接接触。扎针时，因为牛突然摆动会对采血者造成伤害，所以保定人员要将牛保定好，以便于找到牛的颈静脉进行采血。

虎红平板凝集试验（RBPT）操作十分方便、快捷，一般适用于大规模的布病流行病学调查及布鲁菌病阴、阳性检测，但该检测方法特异性会受到时间的影响，有时血清放置过久，阴性动物可能出现假阳性。这时需要将试管凝集试验（SAT）与其结合起来运用，提高特异性，使检测结果更准确。操作时要注意以下事项：虎红平板凝集试验要选用洁净的玻璃板，不能有水，不能有污渍，在上面要用黑色记号笔划分等面积的方格。从-20℃冰箱内取出血清后，需先放于 4℃冷藏处解冻3 h，再拿出来放在室温下恢复到常温。这样操作可避免将血清从-20℃拿到室温环境中，因温差过大而破坏血清，产生沉淀物。

目前该市还没有系统的关于牛布病的流行病学调查，但布病的控制和净化日益受到国家的重视和政府的大力支持，因此掌握该病的流行情况至关重要。该次流行病学调查显示布病感染率为0，说明宜春市在布病防控上取得了一定成效。

布病防控应当着重体现“预防为主，防治结合”的原则，采用检疫、免疫、淘汰患病动物等措施。一定要重视对布鲁菌病的监测，如在布鲁菌病阳性率高的地区，可以反复加强检测，一经发现阳性动物立即淘汰，控制阳性率，净化牛、羊群；根据布鲁菌病的流行病学特点，科学制定相应地区的防控方法，分地区进行综合重点治理，及时切断源头。特别是在大型养殖场，消毒卫生不严格、饲养密度过大以及通风较差都会引起布病的发生［6-7］，因此，一定要做好奶牛日常的饲养管理工作，并定期对牛群进行布鲁菌病的检测，从而保障畜牧业又好又快地发展。