朱亚召，王明丽，俞海洋，高耀辉，赵俊,3*

(1. 安徽医科大学微生物学教研室，合肥 230032； 2.安徽九川生物科技有限公司，安徽芜湖 241000；3. 芜湖留学人员创业园，安徽芜湖 241000)

干扰素是人和动物细胞在受到一定刺激时产生的一种微量、具有高度生物学活性的蛋白质，除了自身具有抗病毒作用，还有免疫调节和抗肿瘤等生物学功能[1]。重组猪α干扰素是将长白猪α干扰素型基因重组质粒导入大肠埃希菌构建表达的原核系统。猪α干扰素(PoIFN-α)对猪的流行性腹泻、轮状病毒腹泻、传染性胃肠炎等多种病毒性病有较好的疗效，因此，其作为广谱抗病毒药可用于猪病毒性疾病的防治。但传统的干扰素提取方法产量较低，难得到推广应用[2-3]。基因工程表达重组猪α干扰素蛋白的方法是通过基因工程技术合成和高密度发酵技术扩大生产，可以有力地提高重组猪α干扰素蛋白的产量，同时缩短生产周期，减少设备投资，并降低生产成本[4]。但目前国内外少有关于重组猪ɑ干扰素发酵动力学的报道，同时实验室高密度发酵技术还不够成熟，常受到微生物发酵过程中的变性和不确定性等因素影响，因此有必要深入地探索大肠埃希工程菌发酵生产重组猪α干扰素的发酵条件和动力学特征，这对提高重组猪α干扰素的产量具有重要意义。为建立大肠埃希工程菌分批发酵动力学模型，在30 L发酵罐中进行了重组猪α干扰素的分批发酵研究，以期实现对重组猪α干扰素生成过程的优化和控制，降低成本，为后续放大实验和连续发酵提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器 重组大肠埃希工程菌(BL21(DE3)/pET-32a-rPoIFNα)由安徽医科大学微生物学教研室提供。培养基种类及组成见表1。蛋白胨(OXOID，英国，批号：1765365，500 g)；酵母粉(OXOID，英国，批号：1378102，500 g)；氯化钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：20160310，500 g)。30 L发酵罐(比欧，瑞士)；紫外分光光度计(Varian公司，美国)；高压蒸汽灭菌锅(HIRAYAMA公司，日本)；重悬仪(IKA公司，德国)；恒温摇床(上海智诚分析仪器制造有限公司)；高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；超声破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司)。

表1 培养基组成Tab 1 Medium components

培养基pH 7.0～7.2，补料培养基和LB培养基121 ℃ 20 min高压灭菌

1.2 实验方法

1.2.1 种子液培养 一级菌种：固体LB氨苄平板上挑取饱满的单菌落接种到终浓度为100 mg/mL氨苄青霉素LB培养液中，37 ℃ 220 r/min培养12～16 h。二级菌液：将一级菌液以0.1%量接种于终浓度为100 mg/mL氨苄青霉素200 mL LB培养基中，37 ℃ 220 r/min扩大培养12 h。

1.2.2 分批发酵过程 在30 L发酵罐中加入发酵培养基12 L，同时添加0.05%的消泡剂，121 ℃ 20 min原位灭菌。冷却后火圈接种200 mL种子培养基和补料培养基至发酵罐中，pH控制范围：7.0 ± 0.1，溶氧控制20%以上，前期发酵温度37±0.5 ℃，菌体生长阶段每1 h取样检测相关参数，3 h后准备诱导；诱导阶段，加入终浓度0.1 mmol/L IPTG诱导表达，温度为32±0.5 ℃，每1 h取样1次检测相关参数，直至发酵结束。共重复6次实验，每次实验条件相同，检测手段相同。

1.3 发酵中参数测定

1.3.1 生物量(wet weight，g/L)测定 取发酵液30 mL于已知质量的离心管中，12000 r/min离心20 min弃去上清，菌体沉淀经蒸馏水洗涤离心两次，收集沉淀。称重，计算所得菌体湿重。

1.3.2 葡萄糖残余含量(Amount of residual sugar，g/L)测定 取发酵液1 mL，12000 r/min离心5 min，收集上清后使用DNS法测得[5]。

1.3.3 全菌目的蛋白检测 分别在诱导前1 h、诱导后1 h、2 h、3 h和4 h取样1 mL进行SDS-PAGE鉴定发酵液中全菌蛋白的表达[6]。

1.3.4 目的蛋白生物学活性(Protein titer, IU/mL)测定 采用细胞病变抑制法，使用成熟的ST细胞/VSV系统[7]对获得重组猪α干扰素蛋白效价检测。

1.4 数据分析和建模 每间隔1h取样，对相关参数进行检测，为建立较为准确的动力学模型，相同条件下，重复6次实验，取实验平均值作为结果进行数据分析，以减少实验误差，同时通过SPSS软件对数据进行统计学分析，并使用Origin 8.0绘图软件对数据进行非线性拟合，绘制动力方程曲线，同时获得最佳动力学参数。

2 结 果

2.1 重组大肠埃希菌分批发酵过程的代谢特征 重组大肠埃希菌产重组猪α干扰素分批发酵过程见图1，显示了菌体湿重、残糖浓度及重组猪ɑ干扰素效价随时间(t)的变化趋势。

图1 重组大肠埃希菌分批发酵进程曲线Fig 1 Recombinant E.coli batch fermentation process curve

图1中菌体湿重呈典型的S型曲线变化。重组大肠埃希菌种子液接入发酵罐后生长分为4个阶段：第一阶段为延滞期，即重组大肠埃希菌接种到发酵罐的适应期，图1显示重组大肠埃希菌适应期很短，很快进入繁殖期。第二阶段为对数生长期，最大比生长速率出现在此阶段。同时，该阶段菌体相关酶活性达到最佳。为了达到较高的细胞密度和提高重组猪ɑ干扰素蛋白产量，选择在对数生长中期，即在接种后第4 h加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导同时降温至32 ℃，此时发酵进入到第三阶段为产物生成期。此时菌体比生长速率降低，产物开始积累，但培养基中葡萄糖浓度已经较低，菌体比生长速率在下降，重组猪α干扰素生成，说明菌体生长和产物生成不存在偶联关系。重组猪α干扰素是随着添加诱导剂才生成的，故为非自发性诱导。随着诱导进行，重组猪α干扰素蛋白生物学升高，说明重组猪α干扰素表达量在增加，但在诱导后第5 h出现生物学活性降低，说明此时菌体开始进入稳定期。由于葡萄糖早已消耗殆尽，不能提供足够的碳源。此时重组大肠埃希工程菌已到达平台期，代谢废物不断积累，无法维持菌体正常的生长环境，大部分菌体不再继续分裂生长，此时结束发酵。

2.2 分批发酵诱导后产重组猪α干扰素的SDS-PAGE鉴定分析 重组大肠埃希菌分批酵诱导前及诱导后取样进行SDS-PAGE鉴定。未使用IPTG诱导，重组猪α干扰素未表达，使用IPTG诱导后在35.0 kD附近泳道3、4、5和6有相对应条带,对应蛋白表达量上升，最终蛋白表达在25.4%左右(图2)。

M：蛋白Marker；1：pET-32a(+)空质粒转化菌；2：重组猪ɑ干扰素诱导前1 h取样全菌；3-6：重组猪ɑ干扰素诱导后1 h、2 h、3 h和4 h取样全菌图2 重组猪α干扰素诱导后发酵取样蛋白鉴定结果Fig 2 Results of the identification of the fermentative sample protein after induction of the recombinant pig α interferon

2.3 发酵动力学模型的建立 使用基于菌体生长动力学的Logistic[8-9]、Luedeking-Piret[10]和类似 Luedeking-Piret等方程研究分批发酵中菌体生长、基质消耗及产物生成间的动力学关系，通过对实验数据的分析，做出以下假设：(1) 发酵过程中菌体生长受自身浓度增加的抑制作用；(2) 葡萄糖的消耗仅用于菌体生长和维持菌体代谢。

2.3.1 菌体生长动力学模型 在微生物生长过程中，Monod动力学模型、逻辑方程和haldane模型[11]等非结构化模型广泛用于描述细胞生长，而Logistic方程的应用却最为广泛，它能较好地描述分批发酵过程中因菌体浓度增加对菌体自身产生的抑制效应[12]，能够清楚地描绘菌体生长与营养间的关系曲线。有学者利用Logistic方程研究大肠埃希菌产青霉素酰化酶[13]、桑葚果酒发酵[14]、1，3-丙二醇分批发酵动力学[15]和仙人掌果酒发酵动力学及其氧化性[16]，结合测得并计算过后整理的相关数据，大肠埃希菌的菌体生长曲线为较标准的S型曲线，能够表示出菌体生长和营养物间的关系。因此，采用 Logistic 方程研究重组大肠埃希菌的菌体生长动力学模型，得式(1)：

X为发酵过程中菌体生物量，g/L；μm为微生物的最大比生长速率，h；Xm为发酵过程中最大菌体质量浓度，g/L；t为发酵过程需要的时间，h。

对式(1)进行积分，化为代数式如下：

X0表示菌体初始浓度，g/L。

图1中菌体湿重数据代入式(2)得生长动力学参数X0、Xm和μm值分别为0.35259、27.46236和1.01385，获得菌体生长动力学方程，见式(3)，同时拟合得曲线方程R2=0.99030，拟合效果很好，故可选用Logistic方程作为菌体生长阶段的动力学方程，见图3。

X表示菌体浓度，g/L；t表示时间，h；R2=0.9903。

图3中菌体生长拟合曲线符合“S”型曲线，菌体在进入对数生长期4h时到达最大比生长速率，此时菌体酶活力达到最佳。故此时进行诱导更有利于提高重组猪α干扰素的产量。

2.3.2 产物生成动力学模型 产物生成与菌体生长关系可分为产物生成与细胞生长偶联、部分偶联或者不相关。在此基础上，通过Luedeking等构建的动力学方程中产物生成与细胞生长关系通过Luedeking-Piret方程进行描述如下：

P表示蛋白产量，X为菌体对应的生物量(g/L),α为生长偶联系数，β则是非生长偶联系数。方程中与菌体生长相关的产物生成用α表示，而与菌体量相关的产物生成用β表示，α，β均为常数。当α=0，β≠0，表示产物生成与细胞无关；当α≠0，对应β=0或者≠0，表示部分偶联和偶联关系。

对图1中重组猪α干扰素生物学活性拟合，得β值为0.01276，见式(6)。拟合得曲线见图4，此时R2=0.91095，证明产物的生成可用该模型表示。

图4中第5 h，取样检测到重组猪α干扰素，且随着诱导发生，蛋白生物学活性提高，但在诱导后第9 h，效价有所下降，说明此时可以结束发酵过程。

S为葡萄糖质量浓度，g/L；X为菌体生物量；YX/S为碳源用于生长的得率常数，g/g；YP/S为碳源用于产物积累的得率常数，g/g；γ为菌体维持系数，g/g。

图3 重组大肠埃希菌菌体生长的模型方程Fig 3 Model equation of recombinant Escherichia coli growth

图4 重组猪ɑ干扰素生成的模型方程Fig 4 Recombinant pig interferon α titer model equation

由于在诱导后的产物生成阶段葡萄糖量很低，可以忽略不计，故化简式(7)并结合式(2)，积分后得：

(8)

S0为初始葡萄糖浓度，g/L；λ=1/YX/S

菌体生长的X0、Xm和μm值分别代入式(8)，并利用图1中残糖量数据非线性拟合，得到S0、λ和γ的值分别为11.89313、-0.44698和-0.6492，代入式(8)得基质消耗与时间的关系见式(10)。

葡萄糖随着重组大肠埃希菌的生长而消耗，尤其在进入对数生长期后，葡萄糖的消耗主要用于维持细菌的生长。在诱导后第4 h，葡萄糖的急剧消耗不仅用于细菌的生长，还用于产物的生成。依图1得出在第5 h时，葡萄糖含量已接近于稳定，此时菌体比生长速率开始下降，即将进入平台期，进行非线性拟合见图5，R2=0.96683 ，证明该模型可以很好的反应出基质消耗情况。

图5 葡萄糖消耗的动力学模型Fig 5 Dynamic model of glucose consumption

2.4 模型验证 为了验证模型的误差，在相同实验条件下又进行了重组大肠埃希菌分批发酵3次，所得实验结果取平均值，并把实验值和模型预测值相比较。经验证，模型的最大相对误差为8.9%，平均相对误差为7.5%，故上述模型能较好地描述重组大肠埃希菌分批发酵动力学，模型的相对误差较小，能够很好的反映重组大肠埃希菌分批发酵过程，可为下一步发酵过程优化提供指导。

3 结 论

研究利用Logistic方程、Luedeking-Piret方程和类似Luedeking-Piret方程建立了大肠埃希菌BL21(DE3)/pET-32a-rPoIFNɑ分批发酵重组猪ɑ干扰素的过程，形成了菌体生长、产物生成和基质消耗动力学模型，分别为：

4 讨 论

国内外关于干扰素抗病毒的研究开始于20世纪50年代，集中在干扰素抗病毒作用。随着近现代基因工程技术的发展，大批量生产干扰素已变得有可能。研究中针对重组大肠埃希菌BL21(DE3)/pET-32a-rPoIFNɑ在30L发酵罐中摸索出产重组猪ɑ干扰素的相关规律，对影响反应的因素进行了整理，采用Logistic方程、Luedeking-Piret方程和类Luedeking-Piret方程模型描述了菌体发酵过程的特性，并经过非线性拟合优化得到相关模型参数，拟合效果较好。这为后续的发酵工艺改进、蛋白活性提高、发酵过程的方法控制以及后续的补料分批模型积累了经验，并提供了指导。

在建立重组猪干扰素α的菌体生长动力学方程中，是基于菌体的湿重测量法建立的菌体生长随时间变化的关系，拟合得到的菌体生长曲线是符合经典的“S”型曲线，拟合效果较好。丁雪利用固态发酵料干物质损失量表示菌体生物量，成功建立了热带假丝酵母固态发酵菌体生长动力学模型[17]，田雪、谢鑫和周晓航等关于地衣芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶分批发酵动力学模型的建立[18]使用菌体干重表示菌体生长，不足之处在于干重法的误差较小，在这方面还需改进。另一方面重组猪干扰素α目的蛋白是分泌型表达，故通过细胞病变抑制法可以准确且稳定地获得其目的蛋白的效价，且蛋白表达量和生物学活性较高，这和菌体自身为pET-32a载体有关构建的可溶性表达有关，可以为后续相关重组蛋白的构建提供可行的指导。

目前初步完成了重组工菌的分批补料发酵实验模型建立，下一步将从工艺优化着手，尤其是从补料发酵开始做进一步精细的研究，构建其补料发酵动力学模型，获得优化后的补料策略，为BL21(DE3)/pET-32a-rPoIFNɑ在后续的高密度发酵甚至扩大到工业化生产上奠定基础。