马华根 唐元瑜 纪立金

(福建中医药大学中医学院， 1 2016级中医专业5年制本科， 2 中医基础理论教研室， 福州 350122)

脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)是构成血脑屏障的主要成分之一,它能通过选择性双向跨细胞膜转运系统及细胞间的紧密连接将脑组织与体循环分隔开,限制蛋白质和大多数极性分子进入脑组织,只有少部分蛋白质和多肽能以转胞吞方式通过血脑屏障进入血液[1];并且BMECs在脑的物质代谢、纤溶与止血、免疫应答等方面也发挥着重要作用,与脑水肿、脑血管疾病的发生发展、脑肿瘤的浸润和扩散,尤其是脑肿瘤的血管生成等病理过程密切相关[2-3]。因此,体外分离培养出BMECs对于后期开展脑血管疾病研究有着重要的奠基意义。而BMECs的体外分离纯化难度较大,国内外虽有相关报道,但各自的培养方法有所不同,尤其是在脑微血管段的分离与细胞纯化方面有较大差异[4]。本课题组参考国内外相关文献,反复试验,多次调整实验方案后,成功获得了数量足够、纯度较高、活性较好的大鼠脑微血管段,并体外培养出大鼠BMECs。

1 材料和方法

1.1 实验动物

7～10日龄Sprague Dawley大鼠4只,雌雄不限,购自福建医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂及仪器

胎牛血清(P161102ES, Pansera公司);M199培养基(1839543, Gibco公司);胰蛋白酶-EDTA混合消化酶液(20170602,南京凯基生物公司);碳酸氢钠(E1724004,阿拉丁公司);肝素(120904,南京新百药业有限公司);磷酸盐缓冲液(P1010)、Triton X-100 (T8200, Solarbio公司);牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)(WXBC44547V)、明胶原蛋白(WXBC4232V, Vetec公司);Ⅱ型胶原酶(461699)、DNaseI酶(25F10220,北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);L-谷氨酰胺(56-85-9)、HEPES(7365-45-9)、嘌呤霉素(CA0070, Leagene公司);兔IgG—免疫组织化学试剂盒SABC即用型(12F07A)、4%多聚甲醛(12D08A68)、rabbit anti-Ⅷ因子抗体(ZP1226BBP26)、DAB显色剂(12F08A22,武汉博士德生物公司)。

美国Thermo CO2培养箱;德国Leica-DFC295倒置生物显微镜;Airtech超净工作台;湘仪公司-TDZ4A-WS低速离心机。

1.3 主要试剂的配制

1%明胶,20% BSA,8mg/L嘌呤霉素,以上试剂均用PBS液配制;0.1% Ⅱ型胶原酶(含40U/ml DNase I),用M199无血清培养基配制;M199培养液(含20%胎牛血清,4000mg/L D-葡萄糖,4mmol/L L-谷氨酰胺,1.9g/L NaHCO3,20mmol/L HEPES,100mg/L肝素钠)用超纯水配制。所有试剂配制后经0.22μm微孔滤器过滤除菌。

1.4 BMECs的原代培养

取4只7～10日龄SD大鼠,断颈处死消毒后,置于超净台内,剪开颅骨取大脑皮质,用预冷PBS液多次漂洗,期间用滴管反复吹打以去除部分血细胞、血凝块和软脑膜。再将大脑皮质剪至肉泥样,加入4ml 20% BSA,匀浆4次,离心,收集上清液再次离心。混合2次离心后的沉淀,滴加8ml 0.1% Ⅱ型胶原酶(含2ml 40U/ml DNaseI酶)于37℃下消化30min,离心,吸取离心管底部的微血管段沉淀,与4ml培养液混匀后接种于1%明胶包被的50ml培养瓶中,将其静置于37℃、5% CO2培养箱中培养48h。其后全量换用含2mg/L 嘌呤霉素的培养液作用48h,之后再次改用不含嘌呤霉素的培养液继续培养,并每隔48h半量换液1次。

1.5 BMECs的传代培养

待细胞培养至接近融合状态时,吸取全部培养液,用37℃预热的PBS液漂洗2遍,然后加入4ml 0.1%胰蛋白酶/0.01% EDTA混合酶溶液,室温下消化2～3min,期间间断性地轻微震荡培养瓶,以促进细胞脱落。镜下观察到大部分细胞变圆、缩小,开始从瓶壁脱落时,滴加4ml培养液以终止消化,吹打混匀,离心,收集沉淀,按1∶2的传代比例分瓶接种后,静置于37℃、5% CO2培养箱中培养。

于倒置显微镜下观察细胞形态、贴壁及融合度等生长状况,并拍照记录。

1.6 第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色检测

待传代于培养皿中的BMECs增殖生长接近70%融合状态时,用PBS液漂洗5min×3次,继而滴加预冷的4%多聚甲醛,常温固定细胞15min;PBS液漂洗5min×3次,滴加0.3% Triton X-100常温透膜15min;PBS液漂洗5min×3次,滴加5% BSA室温封闭20min;弃封闭液,滴加1∶300稀释的兔抗人Ⅷ因子多克隆抗体,置于湿盒中4℃过夜;PBS液漂洗5min×3次,滴加羊抗兔二抗,37℃孵育30min;PBS液漂洗5min×3次,滴加SABC,37℃孵育30min;PBS液漂洗5min×3次,DAB室温显色1～2min;PBS液再次漂洗后,置于倒置显微镜下观察并拍照。

2 结果

2.1 形态学观察

倒置显微镜下观察可见： 接种于培养瓶中的脑微血管段呈长短不一的单枝、分枝状,或收缩折叠成“串珠样”(图1A)。培养24～48h后可观察到贴壁的血管段出芽生长,呈“蜈蚣虫样”,周围爬出短梭形或多角形的内皮细胞(图1B);3d左右可见“岛屿状”或“团簇样”分布的细胞集落(图1C);4～6d集落逐渐融合(图1D-1F);7d后细胞长满瓶底,“涡旋状”分布,呈典型的“铺路石样”单层贴壁生长(图1G)。

2.2 第Ⅷ因子免疫细胞化学染色检测

免疫细胞化学染色检测Ⅷ因子相关抗原蛋白表达呈阳性,阳性细胞率达99%以上。镜下可见细胞胞质淡染成棕黄色,胞核呈空泡状(图1I)。

3 讨论

原代大鼠BMECs的体外分离培养,其主要技术难点在于血管段不易获取、活性较差以及易受杂细胞污染等[4-5]。本课题组参考国内外相关文献,通过反复试验探索,有效地解决了以上问题,成功分离培养出大鼠BMECs。

通过本次实验,课题组体会到： (1) 取材对象的选择对血管段的得率及纯度有较大影响。国内学者鲍欢等[6]提出可选用1～3日龄的SD乳鼠,因其BMECs已经分化,分裂增殖能力强,且血脑屏障的结构较薄弱,脑微血管段易于分离;而田林郁等[7]认为应选用4～6周龄的SD大鼠,因为新生鼠脑组织较少,且用其培养的BMECs易混入较多的杂细胞。本课题组则认为,7～10 日龄的SD大鼠脑发育未完全,血管段较易从组织中游离,同时该日龄大鼠的BMECs分裂增殖能力强,因而具有群体优势,且培养出的BMECs杂细胞较少,是良好的取材对象;(2) 较高的血管段接种密度有利于BMECs的存活与生长,因此增加单位面积内血管段的接种数量是BMECs存活的关键[6]。本实验结合许熊飞等[8]提供的方法,采用20% BSA去髓鞘,相对于15%葡聚糖而言,其分离获得的脑微血管段数量更多,状态更好,更容易贴壁生长;且BSA离心后收集上清液进行二次离心,显示试管底部还有血管段沉淀,因此再次离心可获得更多的血管段,从而增大了接种密度,有利于BMECs间生长信号的相互传导并促进其生长;(3) 脑微血管段接种后,在合适时间段内添加适当浓度的嘌呤霉素可有效纯化目的细胞BMECs。嘌呤霉素为蛋白质合成抑制剂,内皮细胞因能独特地表达多耐药蛋白1而对嘌呤霉素具有耐药性,其他细胞则不具有该特性,故可选用嘌呤霉素作为纯化试剂。查雨锋等[9]提出接种血管段时,添加终浓度为4mg/L的嘌呤霉素,作用48h可有效抑制杂细胞生长;而张作慧等[10]则通过实验比较表明： 2mg/L的嘌呤霉素纯化BMECs的能力与4mg/L相当,但4mg/L的嘌呤霉素会影响BMECs的增殖活力,导致细胞增殖缓慢、产量减少,而2mg/L嘌呤霉素则影响较小。此外,嘌呤霉素作用的时间也非常关键,过早加入会导致大量BMECs漂浮死亡;同时,原代BMECs在体外培养过程中,多耐药蛋白1表达会降低[11],因而对嘌呤霉素的抵抗能力亦减弱。所以课题组综合了以上嘌呤霉素的量效和时效等诸多影响因素,于接种48h后全量换用含2mg/L嘌呤霉素的培养液,48h后再次改用不含嘌呤霉素的培养液继续培养,最终免疫细胞化学显色结果显示,纯化率可达99%以上。

图1 BMECs的培养及形态学观察与鉴定

此外,提供足够数量的受试BMECs也是保证实验正常开展的前提和基础,所以笔者认为原代BMECs的传代培养对于下一步实验的开展至关重要,需重视其传代的时机、比例以及消化酶的合理使用。在BMECs传代的时机上,课题组选择在细胞对数生长期进行,此时的细胞活性高,传代后更易存活;而传代使用的消化酶则选用浓度较低的0.1%胰蛋白酶/0.01% EDTA混合酶溶液,消化时镜下观察到大多数细胞变圆缩,呈流沙样从瓶底脱落时即终止其消化,以减少胰蛋白酶对细胞的化学损伤;同时传代的比例不宜过大,按1∶2进行,以保证细胞的接种密度,从而更有利于传代细胞的贴壁生长。值得注意的是,BMECs的传代次数有限,不能连续传代[12]。如钱志远等[13]认为体外培养的BMECs可传至30代而保持其细胞生物学特性基本不变,刘恺鸣等[4,14]则认为BMECs传至4代时,其形态及生物学特性已发生改变。本实验结果亦显示BMECs传至4～5代时,就已出现细胞分裂增殖缓慢、融合时间延长以及胞质中有大量空泡等老化现象,故宜采用4代以前的BMECs作为实验受试细胞。

总之,本课题组在大鼠鼠龄的选择、血管段接种的密度、细胞的纯化、培养液的配制等方面进行了反复实践和探索,摸索出了一种操作简便,重复性强,可培养出纯度高、活性好的原代BMECs培养方法,这亦为体外血脑屏障的建立及脑血管疾病的研究奠定了重要的细胞生物学实验基础。