常志尚 毋亚仙 刘立娜 谭金山 刘 颖 梁 惠

(青岛大学, 1 生物医学公共支撑平台, 2 基础医学院2016级医学检验技术专业, 3 国家重点实验室培育基地, 4 基础医学院, 5 公共卫生学院, 青岛 266071)

近年来,随着人口老龄化及人们生活水平的提高,糖尿病的患病率逐年升高[1]。多项研究证实,肠黏膜屏障功能异常与糖尿病的发生发展密切相关[2]。细胞之间连接装置在维持肠黏膜机械屏障结构和功能完整性方面发挥重要作用[3],因此,熟悉和掌握细胞间连接装置形态学变化及其检测方法,对了解糖尿病肠黏膜屏障损伤状况具有重要意义。透射电镜技术是生物医学领域广泛应用的重要研究手段,但透射电镜技术对生物样品切片制样及超微结构分析都提出了严格要求,不同的组织材料需采用不同的制样条件,若处理不当,可导致实验结果失真甚至实验失败[4]。本研究采用高脂饮食联合链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立糖尿病大鼠模型,优化制样条件制备回肠组织超薄切片,采用透射电镜对肠上皮细胞连接装置进行超微结构观察和分析,旨在为糖尿病影响肠黏膜机械屏障结构与功能提供客观依据,现报告如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

STZ购自北京Solarbio科技有限公司;柠檬酸、柠檬酸钠、戊二醛、四氧化锇、812环氧树脂、甲苯胺蓝、醋酸双氧铀、柠檬酸铅，均为分析纯,购自北京国药集团化学试剂有限公司;高脂饲料(猪油10%、蔗糖20%、蛋黄粉15%、胆固醇1.2%、猪胆盐0.2%、鼠维持饲料53.6%，均为国产);claudin、occludin、ZO-1一抗购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 STZ溶液配制

称取柠檬酸2.1g,加入双蒸水100ml中配成A液;称取柠檬酸钠2.94g，加入双蒸水100ml中配成B液。A液与B液以1∶1混合,调节pH至4.2～4.4。称取1.0g STZ,加入柠檬酸缓冲液至100ml溶解。冰上保存,现用现配,配好的溶液在30min内注射完毕。

1.3 模型建立与分组

雄性Wistar大鼠30只,体质量(180±20) g,购自山东鲁抗医药股份有限公司,动物合格证号为SCXK(鲁)20130001。随机分为2组： 正常对照组和模型组。普通饲料适应性喂养1周后,禁食不禁水12h,尾静脉取血检测空腹血糖,作为该批次动物基础血糖值。正常对照组继续饲喂普通饲料,模型组更换高脂饲料,喂养30d后,模型组大鼠腹腔注射1% STZ溶液,正常对照组注射柠檬酸缓冲液。继续喂养1周后,禁食不禁水12h,再次检测尾血血糖,血糖值>11.1mmol/L即为建模成功。成模大鼠继续饲喂高脂饲料,正常对照组大鼠饲喂普通饲料,持续4周,并于第4周末禁食不禁水12h,再次检测尾血血糖。30%乌拉坦麻醉大鼠,剖开腹腔,腹主动脉取血处死大鼠,迅速分离回盲部以上4cm回肠组织,部分用于透射电镜超微结构观察,部分用于免疫印迹检测。

1.4 空腹血糖水平检测

采集尾血,采用罗氏血糖仪测定各组动物血糖值。

1.5 大鼠肠上皮细胞连接装置超微结构观察

采用透射电镜技术对各组大鼠回肠组织细胞间连接装置病理形态学变化进行超微结构观察。具体步骤如下：

1.5.1 取材 各组随机留取5只大鼠回肠组织1cm,37℃温生理盐水迅速漂洗3次,滤纸拭干,迅速将肠组织置于蜡盘上并滴加4℃预冷的2.5%戊二醛溶液。用锋利刀片切取1mm×2mm肠壁组织块2块,迅速投入预冷的2.5%戊二醛固定液中,4℃保存。

1.5.2 脱水包埋 取戊二醛固定后肠组织样品,PBS(pH=7.2)漂洗3次,1%四氧化锇后固定80min,梯度丙酮脱水,812环氧树脂包埋,聚合。

1.5.3 半薄切片制备 修整包埋块并将其置于超薄切片机上,用钻石刀切出1μm厚度半薄切片,1%甲苯胺蓝染色30s,流水冲洗,晾干。

1.5.4 肠组织定位 取半薄切片置显微镜下观察,选择肠腔内侧面、染色清晰、切面完整的区域作为超薄切片目标区域,根据半薄切片图像提示从样品块上选取目标区域,以目标区域为中心将样品断面修成0.2mm×0.2mm的正方形。

1.5.5 超薄切片制备及染色观察 将定位后的样品块置于超薄切片机上,使用钻石刀切取超薄切片,切片厚度70nm,刀速1mm/s连续湿式切片,150目方华膜铜网捞片。醋酸双氧铀柠檬酸铅染色。使用透射电镜对各组大鼠肠上皮细胞连接装置进行观察拍摄。

1.6 大鼠肠黏膜细胞紧密连接相关蛋白表达水平检测

采用免疫印迹检测各组大鼠回肠组织claudin、occludin、ZO-1蛋白表达水平,以β-actin作为内参照,结果经扫描后输入计算机,并进行图像分析。实验重复3次。

1.7 统计学处理

应用SPSS 16.0软件进行数据统计分析,计量资料采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 血糖水平检测

注射STZ 1周后,筛选模型组血糖值>11.1mmol/L的大鼠组成新的模型组,其血糖值较正常对照组显著增高(P<0.05)。持续喂养4周后,模型组血糖值依然保持在较高水平,与正常对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),且血糖值无明显回落现象(表1)。

表1 各组大鼠血糖水平检测

*P<0.05vsnormal control group

2.2 肠上皮细胞连接装置超微结构病理学变化

正常对照组5只(5/5)大鼠回肠组织肠上皮细胞连接装置形态结构均正常,无缝隙增宽等异常病理学表现。模型组5只(5/5)大鼠紧密连接与正常对照组比较稍感松弛,电子密度均有所降低;同时,中间连接、缝隙连接等连接装置出现缝隙明显增宽现象(图1)。

2.3 肠黏膜细胞紧密连接相关蛋白表达水平变化

模型组大鼠回肠组织claudin、occludin、ZO-1蛋白表达水平均较正常对照组显著降低(P<0.05),提示糖尿病大鼠肠黏膜细胞紧密连接相关蛋白表达受到抑制(图2)。

图1 各组大鼠肠上皮细胞连接装置超微结构病理学观察

3 讨论

透射电镜是以电子束作为“光源”,通过电磁透镜成像的电子光学仪器,放大倍数可达几十万倍[4]。透射电镜技术在各种组织超微结构病理学观察过程中发挥无可替代的关键作用,同时,其组织切片的制作质量对观察效果也有较大影响[5]。首先,超薄切片技术是透射电镜技术中最重要、最基本、最常用的技术,由于电子穿透力低,观察样品必须制备成超薄切片,通常为70nm左右,其步骤较石蜡切片更复杂、要求更严格[6]。其次,透射电镜切片要求取材部位准确、一致。本研究为避免取材部位不同造成结果差异,统一将取材部位定为回盲部以上4cm回肠组织,从而保证观察结果更具可比性。第三,由于肠道表面有皱襞、绒毛等结构,必须仔细清洗肠腔表面残留的肠内容物,否则会影响切片质量,损坏钻石刀。本研究在取材过程中,对回肠组织采用37℃温生理盐水清洗30s,以模拟组织在体环境,解决了常规4℃预冷生理盐水清洗样品发生肠道组织遇冷收缩不易清洗干净的情况。第四,四氧化锇后固定时间的选择也是制样过程中的重要一步。固定时间过长会造成样品太脆不易切片、固定时间不足会造成切片衬度过低[7]。本研究不断优化实验条件,显示回肠组织使用1%锇酸后固定80min效果最好。第五,由于超薄切片面积小,需要对样品进行半薄切片精确定位。本研究主要观察肠上皮细胞连接装置,在定位过程中选取肠腔内侧、染色清晰、切片完整的区域作为目标区;同时,修块时肠腔内侧游离面外保留了一部分包埋剂,且内侧边缘与切片方向平行或成锐角,避免出现切片厚度不均或断裂的现象。此外,本研究采用甲苯胺蓝对半薄切片染色后定位,与范晓燕等[8]介绍的不染色直接在相差显微镜下观察不同,染色后组织结构更清晰易辩,并且使用普通生物显微镜即可观察,方便了对样品待观察部位的精确定位。

图2 大鼠回肠组织细胞紧密连接相关蛋白表达水平

本研究成功制备糖尿病大鼠回肠组织透射电镜切片,并对肠上皮细胞连接装置进行超微结构形态学观察,以便直接客观了解糖尿病大鼠肠黏膜机械屏障功能状况。细胞连接是细胞之间相互联系、发挥协同作用的重要超微结构,主要包括紧密连接、中间连接、桥粒、缝隙连接等,其中,紧密连接是肠黏膜上皮细胞间最主要的连接方式,在封闭细胞间隙,维持肠道屏障结构与功能完整性方面发挥决定性作用;中间连接、桥粒及缝隙连接具有黏合细胞、增强组织机械性、协调细胞间运动等作用[9]。细胞连接装置异常增宽,可使肠壁完整性遭到破坏,肠黏膜屏障功能受损,致使肠道内某些有毒物质进入血液循环,对机体组织器官造成损害,导致多种疾病的发生。

本研究采用透射电镜技术对肠黏膜细胞连接装置超微结构进行观察,获得了良好的效果。结果证实,糖尿病大鼠肠上皮细胞连接装置发生缝隙增宽、电子密度降低等异常病理变化,与相关报道一致[10]。为验证透射电镜观察结果,本研究采用免疫印迹对回肠组织中部分紧密连接相关蛋白进行了检测。其中,claudin、occludin为跨膜蛋白,是构成紧密连接的主要骨架蛋白,ZO-1为膜周蛋白,它们对维持肠黏膜上皮细胞极性和调节肠黏膜屏障通透性具有重要作用[11]。结果显示,糖尿病大鼠回肠组织claudin、occludin及ZO-1蛋白表达水平较正常对照组明显下调,与透射电镜观察结果一致，表明通过透射电镜观察细胞连接病理学变化具有较高的可靠性。