（河北医科大学法医学院 河北省法医学重点实验室，河北 石家庄 050017）

血栓致死的法医学案件中血栓形成时间是法医病理学研究和亟待解决的难点和重点。创伤等外部事件发生肺栓塞死亡的案例中，法医检案时面临的关键问题是判断此次创伤与肺栓塞是否存在因果关系，肺内血栓如何形成、何时形成及其来源，血栓形成是否与创伤存在时间上的先后[1-2]等。在原发性和（或）继发性危险因素作用下血液纤溶和凝血系统稳态失衡，血液在体内异常凝结形成血栓。因各种原因血栓可由其原始形成部位脱落，随血液循环到肺形成肺栓塞。血栓的形成转归过程为血栓形成、血栓机化和再通。血栓的形成是一个动态的过程，但针对血栓动态形成的时间特异性指标还未阐明。血栓形成时序性变化规律对于揭示血栓形成特定时间变化具有重要意义，这对于解决涉及创伤、疾病等复杂肺栓塞法医学案例的血栓形成时间、来源等问题具有指导意义。

本研究通过建立大鼠下腔静脉血栓动物模型，采用特殊染色观察血栓形成不同时期组织结构变化特点，并通过免疫组织化学技术观察CD61、α-SMA和CD34的表达变化，研究血栓形成不同时期特异性变化指标，以期为血栓形成致死性法医学案件的血栓形成时间鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康成年雄性SD大鼠80只（河北医科大学实验动物中心提供），体质量（250±10）g，随机分为 10 组：建模术后 0 h、3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、1 周、2 周、3 周和4周组。每组8只大鼠。

1.2 主要试剂和仪器

兔来源CD61、CD34抗体［艾博抗（上海）贸易有限公司］，兔来源α-SMA抗体（美国Affinity Biosciences公司），生物素化二抗工作液SP-9000（北京中杉金桥生物技术有限公司）；BX61型荧光显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 动物模型的建立

依据文献[3]，经大鼠腹部正中切口入腹，逐层切开至腹腔，切口长度约2cm（下至凝固腺上叶上缘，上至露出肝组织一角），将小肠拨向腹部两侧充分显露下腔静脉。打开后腹膜，充分游离下腔静脉及其各属支，用1#缝合线结扎左肾静脉水平以下下腔静脉各静脉属支。确认左肾静脉下2～3mm处为下腔静脉结扎点，结扎点下穿过一条4#缝合线，另沿下腔静脉走行方向并行放置一条4#缝合线。结扎缝合线至稍有阻力且恰能抽出并行放置的4#缝合线，谨慎抽出并行的4#缝合线。完成深静脉血栓“狭窄法”模型。依据下腔静脉侧支循环形成，确定观察血栓形成最长时间分组。

1.4 样品制备

建模术后分别依据各时间分组取材。取材时以10%水合氯醛溶液（0.5mL/kg）腹腔麻醉大鼠，自结扎点起取长度1 cm下腔静脉段，取材后以10%中性甲醛溶液固定12h，脱水、透明、浸蜡、包埋，4℃保存备用。采用石蜡切片机将术后各组分别切片后行HE染色、Perls染色、Von Kossa染色和链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）免疫组织化学染色。

1.5 结果分析

1.5.1 观察指标

HE染色观察血栓形成、机化和再通的大致过程；Perls染色和Von Kossa染色分别观察各组含铁血黄素析出及钙盐沉积情况；SP免疫组织化学染色观察CD61、α-SMA、CD34表达情况，其抗体浓度分别为1∶300、1∶400、1∶4000。

显微镜图像采集后，运用Image-Pro Plus 6.0软件分别计算各组切片含铁血黄素（Perls染色中呈蓝色）、钙盐沉积（Von Kossa 染色中呈黑色）、CD61（血栓组织呈棕黄色）阳性表达部位的累积光密度（integrated optical density，IOD）值。显微镜下每组切片选取10个随机视野，运用Image-Pro Plus 6.0软件计算α-SMA阳性细胞个数。显微镜Olympus cellSens Dimension软件计算新生血管腔面积（CD34阳性表达）与原有血管腔面积百分比。

1.5.2 统计学处理

2 结 果

2.1 血栓形成、机化和再通

术后0h未见血栓形成（图1A）；术后3h微量血小板血栓形成（图1B）；术后6h血管壁边缘少许白色血栓形成（图1C）；术后12h片状血小板小梁形成；术后1d大量血小板小梁形成（图1D）；术后3d血栓增生样改变（图1E）；术后4周血栓组织机化，血管部分再通（图1F）。

2.2 Perls染色、Von Kossa染色

2.2.1 Perls染色

Perls染色可将含铁血黄素颗粒染成蓝色，其他组织染成红色。由图2可见：建模术后0h～1d未见含铁血黄素颗粒；含铁血黄素颗粒最早见于术后3d，散落于血栓内部；术后3d～4周含铁血黄素颗粒呈增多趋势，至术后4周机化的血栓组织中释放出大量含铁血黄素颗粒。Perls染色观测血栓中含铁血黄素颗粒的IOD值结果见表1。

图1 血栓形成、机化和再通（HE×100）

图2 含铁血黄素颗粒（Perls×100）

表1 Perls染色观测血栓中含铁血黄素颗粒（n=8，±s）

表1 Perls染色观测血栓中含铁血黄素颗粒（n=8，±s）

注：1）与相邻上组比较，P＜0.05

组别 IOD 1d 0 3d 514.23±168.65 1 周 945.16±29.331）2 周 1200.37±223.971）3 周 1620.59±520.031）4 周 2980.67±2080.981）

2.2.2 Von Kossa染色

Von Kossa染色可将钙盐沉积染成黑色，其他组织呈红色。建模术后0h～3d未见钙盐沉积，术后1周血栓内见散在钙盐沉积。随建模时间的延长，钙盐沉积增多，包含大量钙盐的异物巨噬细胞体积增大、数量增多，未经吸收的钙盐直接存在于血栓组织中形成血栓钙化，最终形成静脉石（图3）。Von Kossa染色观测血栓中钙盐沉积颗粒的IOD值结果见表2。

图3 钙盐沉积（Von Kossa×100）

表2 Von Kossa染色观测血栓中钙盐沉积颗粒（n=8，±s）

表2 Von Kossa染色观测血栓中钙盐沉积颗粒（n=8，±s）

注：1）与相邻上组比较，P＜0.05

组别 I O D 3 d 0 1 周 1 7 8 1.7 0±1 6 8.8 0 2 周 1 9 4 2.1 7±3 5 9.3 9 3 周 3 4 4 6.8 3±9 0 5.3 4 1）4 周 4 9 9 8.2 5±7 0 0.9 0 1）

2.3 免疫组织化学染色

CD61最早于术后3h在血栓内部散在表达（图4A）；术后3～6h差异无统计学意义；术后1d达到峰值（图4B）；随后开始下降，至术后2周CD61表达最低（图4C）；随后在机化的血栓与管腔形成的二次狭窄部位新形成的血小板血栓内重新表达（图4D），但低于其峰值。各组免疫组织化学染色观察血栓中CD61的表达见表3。

图4 CD61 的表达（SP×100）

表3 免疫组织化学染色观察血栓中CD61的表达（n=8，±s）

表3 免疫组织化学染色观察血栓中CD61的表达（n=8，±s）

注：1）与相邻上组比较，P＜0.05；2）与 1d 组比较，P＜0.05

组别 I O D 0 h 1 5 6.3 5±7 5.4 6 3 h 3 7 1 2.6 2±2 5 1 3.0 9 1）6 h 3 8 7 1.8 9±1 3 8 8.4 2 1 2 h 5 0 9 0.4 0±7 2 6.5 5 1）1 d 6 9 9 8.2 8±2 4 6 9.7 3 1）3 d 3 9 7 4.5 1±2 2 7 2.0 4 1）1 周 3 6 9 2.0 6±3 8 1.2 4 2 周 2 4 7 4.3 3±1 4 4 4.4 6 1）3 周 4 6 2 5.6 1±1 5 7 7.3 2 1）4 周 6 1 0 9.3 4±8 6 9.5 4 1）2）

由图5可见：α-SMA的阳性表达最早见于术后3d的血栓组织边缘，术后1周表达达到高峰。各组免疫组织化学染色观察血栓中α-SMA的表达见表4。

CD34最初少量表达于术后3d靠近管壁的血栓部位的新生内皮细胞内（图6B）；术后1周开始有相对较大的新生血管形成，CD34表达面积（新生血管腔面积）约占原有血管腔面积的7.46%，该新生血管通常位于与管壁紧密连接的血栓外部，但内部亦可见（图6C）；术后2～4周，新生血管融合成较大管腔的血管，术后4周CD34表达面积可达原有血管腔面积的21.61%，其内有新鲜血液流动（图6D～F）。各组免疫组织化学染色观察血栓中CD34的表达（新生血管腔面积）见表5。

图5 α-SMA 的表达（SP×100）

图6 CD34 的表达（SP×100）

表4 免疫组织化学染色观察血栓中α-SMA的表达（n=8，±s）

表4 免疫组织化学染色观察血栓中α-SMA的表达（n=8，±s）

注：1）与相邻上组比较，P＜0.05

组别 阳性细胞数1d 0 3d 44.86±15.27 1 周 75.40±35.471）2 周 57.22±16.391）3 周 43.40±16.401）4 周 65.75±14.801）

表5 免疫组织化学染色观察血栓中CD34的表达（n=8，±s，%）

表5 免疫组织化学染色观察血栓中CD34的表达（n=8，±s，%）

注：1）与相邻上组比较，P＜0.05

组别 新生血管腔面积1d 0 3d 0.44±0.05 1 周 7.46±6.081）2 周 17.73±7.371）3 周 19.74±6.471）4 周 21.61±4.351）

3 讨 论

血栓形成是一个动态过程，常有血小板、纤维蛋白、红细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞等多种成分参与，这些成分通过影响血液纤溶和凝血系统引起血栓。血小板黏附于受损血管内膜是血栓形成的初始步骤，CD61抗原为整合素的β3链，CD41抗原为整合素的 αⅡb 链，两者共同形成 CD41/CD61（GPⅡb/Ⅲa）复合物，该复合物在细胞聚集方面发挥重要作用，其与纤维蛋白原等的结合是血小板凝集过程的最后途径[4]。血小板凝集在血管内膜，形成混合血栓的头部。本研究通过免疫组织化学法检测CD61含量的变化，在术后3h即可见阳性表达，术后1d达到高峰，可见广泛的血小板小梁形成，而后表达有所下降，至术后4周血栓与管腔形成的二次狭窄腔隙内新生的白色血栓部位CD61重新表达，但表达量均低于其峰值。

在血栓形成的过程中，成纤维细胞的出现与血栓内胶原的形成通常相互并行[5]。成纤维细胞是一种多形性细胞，当成纤维细胞合成胶原时，呈典型的星状或纺锤状外观。且成纤维细胞尚参与体内多种器官纤维化的过程，当在身体任何部位造成创面时，早期主要是多形核粒细胞，然后逐渐出现淋巴细胞，直到第3天才出现成纤维细胞，然后迅速增多。成纤维细胞具有分化为平滑肌的能力[6]，本研究选取的平滑肌动蛋白特异性抗体α-SMA最早可见于术后3d，这与成纤维细胞出现的时间相一致。

含铁血黄素是由于组织内发生出血、长期慢性淤血及其他病变时，红细胞释放出血红蛋白分解破坏的产物，或者说是红细胞释放出的血红蛋白被巨噬细胞吞噬后，经溶酶体降解为含铁血黄素[7]。资料[8]表明，含铁血黄素在血红蛋白释出后2～3d开始形成，含铁血黄素可见于组织局部存在陈旧性出血灶、梗死灶内的各种出血性病变内。本研究发现，含铁血黄素最早见于血栓形成第3天，通常在血栓形成的1周后或更长时间检出量增加，这对于创伤时间推断可提供有效佐证。

新近形成的血栓可被溶解吸收，长久形成的血栓既不被溶解又不被充分机化时，可发生钙盐沉积，最终可形成静脉石堵塞血管。Von Kossa染色是一种钙质染色法，可将钙盐沉积区染为黑色。本研究于术后1周血栓内见散在钙盐沉积，血栓转归过程中随着时间延长钙盐沉积增多。血栓内出现钙盐沉积可以反映血栓形成处于晚期。

目前广泛应用的血管内皮特异性标记物有CD31/CD34、Tie2、E9、TEC 等[9-11]，CD34 为血管内皮细胞的特异性标记物，仅表达于血管内皮细胞[12-13]。研究[14]发现，CD34参与血管内皮损伤部位的血管新生、修复和保持血管内皮完整。一般认为，除造血干细胞表达CD34外，微血管内皮细胞也表达CD34[15]。熊正文等[16]研究认为，CD34相关抗原更敏感，能突出显示较小的、不成熟的微血管或单一的内皮细胞。本研究选用CD34作为血管内皮的特异性标记物，最早于术后3d在血栓边缘发现其少量阳性表达，术后2周新生小血管数量大量增加，并可见较大管腔血管。血栓内部开始出现新生血管说明已处于血栓机化再通时期。

血小板、血管内皮细胞和成纤维细胞广泛参与了机体血栓形成的过程。在血栓形成及转归过程中，上述成分特定时间的病理学形态特点符合一般规律，但也有其特征性表现。单纯的HE染色因其局限性很难对血栓形成时间进行细致划分。本研究结果示：术后3 h可见CD61阳性表达并于术后1 d达高峰；术后3d见含铁血黄素析出，α-SMA阳性表达；术后1周见钙盐析出，CD34阳性表达。含铁血黄素、钙盐和CD34表达呈时间依从性的递增趋势。而α-SMA自术后1周达到峰值后呈下降趋势，术后4周时表达重新增多可能由于新生血管的增多，在部分新生成毛细血管平滑肌内表达。术后4周血栓与管腔形成的二次狭窄腔隙内新生的白色血栓部位CD61重新表达，但表达量低于其峰值。上述指标参与了血栓形成，其起始出现的时间对于血栓形成时间推断有一定意义：CD61可用于血栓形成3h及血栓再形成时期（4周）的时间推断，含铁血黄素、α-SMA可用于血栓形成3 d的时间推断；钙盐、CD34可用于血栓形成1周的时间推断。以上血栓形成不同时间的特异性特点可为血栓形成时间推断提供参考依据。本研究在术后4周已发现CD61、α-SMA二次表达上调的趋势；含铁血黄素、钙盐和CD34自起始表达后呈时间依从性的递增趋势；且建模4周时结扎的大鼠下腔静脉已有明显侧支循环的建立，血管再通明显；4周后血栓形成时间推断尚待进一步研究。

综上所述，以上标记物在血栓形成过程中时序性出现的特点有望对血栓形成时间推断提供新的思路。但由于血栓形成是一个动态的过程，本研究未进行4周后更长时间的研究，对于血栓形成时间的具体推断仍需进行更深入的研究。以上研究所得仅在动物实验得到确定，有待于在人体得到进一步验证从而用于法医学实践过程。