刘 博，戚 诚*，赵 爽，赵晓东，刘学臣，张立超，石 畅

0 引言

食管癌发病率在全球呈现上升趋势，在消化系统恶性肿瘤中，其死亡率较高。食管癌以发现晚为特点，5年生存率极低，大部分食管癌发现时均无手术机会[1]。目前，放化疗是药物治疗不能手术的食管癌的主要治疗方式[2]，中药在恶性肿瘤中的应用已经取得了极大进展，尤其中药联合化疗药物的应用，可以达到提高治疗有效率、减少化疗药物剂量及毒副反应、延长患者生存期的目的[3-5]。华蟾素是近年应用的抗肿瘤药物之一，在肺癌及胃癌等恶性肿瘤中有应用[6]，获得了肯定的效果，但目前其在食管癌中的作用及机制研究缺乏客观实验证据。本研究采用华蟾素联合氟尿嘧啶，观察食管癌离体细胞增殖、凋亡及细胞周期的变化，评价华蟾素对食管癌细胞的杀灭作用及对氟尿嘧啶化疗增效作用，并探讨其作用机制，为临床应用提供客观实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人食管癌细胞株TE-1购自上海中科院细胞库，采用含10%胎牛血清、青霉素及链霉素的1640培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱进行贴壁细胞培养。0.25%胰蛋白酶进行消化传代，取对数生长期的TE-1细胞进行实验，所有的实验均重复3次，以平均值进行统计。华蟾素注射液(CAS No.521-61-9)购自安徽华润金蟾药业股份有限公司，氟尿嘧啶注射液(CAS No. 51-21-8)购自上海旭东海普药业有限公司。ECL发光试剂盒、DAB显色试剂盒及BCA定量试剂盒均购自南京凯基生物公司。MTT试剂盒购自美国Biosharp公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒购自美国Millpore公司；Bcl-2单克隆抗体、Bax单克隆抗体、Cleaved PARP多克隆抗体及Survivin多克隆抗体均购自美国Santa Cruz生物技术公司。实验细胞分为阴性对照组(Negative Control组)、华蟾素干预组(Cinobufotalin组)、华蟾素及氟尿嘧啶共同干预组(Cinobufotalin+5-FU组)及氟尿嘧啶组(5-FU组)，Negative Control组给予DMSO干预作为空白对照，Cinobufotalin+5-FU组及5-FU组氟尿嘧啶浓度均为25 μmol/L。

1.2 方法

1.2.1 Western印迹 Cinobufotalin组以0、5、50、500 μmol/L浓度梯度华蟾素作用48 h后，依照细胞蛋白提取试剂盒规定步骤进行蛋白提取，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白进行分离并电转移至PVDF膜上。加入5%脱脂奶粉，在室温条件下进行90 min封闭后，分别加入Bcl-2、Bax、Cleaved PARP及Survivin一抗，进行孵育过夜后加入对应二抗，再孵育后进行化学发光法显色。应用Quantity One对灰度值进行定量分析。

1.2.2 流式细胞术检测TE-1凋亡及细胞周期 Cinobufotalin组、Cinobufotalin+5-FU组(50 μmol/L华蟾素干预24 h)、Negative Control组及5-FU组TE-1细胞培养48 h后转移至EP管，给予预冷及PBS洗涤后加入预冷70%乙醇，在4 ℃温度下固定24 h。1 000 r/min 离心10 min后弃上清。对每个样品均采用PBS重悬，加0.5% PI 40 μl、RNase A 20 μl(10 mg/ml)，4 ℃下避光温浴35 min，上流式细胞仪进行细胞周期检测。另取培养48 h的各组细胞，依据Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书规定步骤测定细胞凋亡，软件Cell Quest进行凋亡率分析，计算早期凋亡阳性的细胞百分比。

1.2.3 MTT法检测不同华蟾素浓度梯度及不同培养时间TE-1细胞存活率 各组细胞以6×104/ml数加入96孔板内培养6 h，细胞贴壁后Cinobufotalin组及Cinobufotalin+5-FU组加入0、5、10、15、20、25 μmol/L浓度梯度的华蟾素作用48 h，每个浓度均设3个复孔。48 h后在每孔内均加入5 mg/L的10% MTT液，在37 ℃温箱孵育4 h后弃上清，加入150 μl DMSO，震荡25 min后进行光密度值(OD值)测定，计算细胞存活率。另取细胞待贴壁后Cinobufotalin组及Cinobufotalin+5-FU组细胞加入50 μmol/L的华蟾素，分别在细胞培养24、48、72、96 h后行MTT检测，步骤同前，测定TE-1细胞在不同时点存活率。

2 结果

2.1 华蟾素干预后凋亡相关蛋白的表达 Western blot检测0、5、50、500 μmol/L浓度梯度华蟾素干扰前后凋亡相关蛋白变化。随着Cinobufotalin浓度升高，Bcl-2、Survivin蛋白表达水平呈剂量依赖性下降，与0 μmol/L浓度对比，Bcl-2蛋白表达在5、50、500 μmol/L差异有统计学意义(t=6.922，P<0.01；t=7.736，P<0.01；t=11.075，P<0.01)，Survivin蛋白表达在50、500 μmol/L差异有统计学意义(t=5.248，P<0.01；t=12.663，P<0.01)；随着Cinobufotalin浓度升高，Cleaved PARP、Bax蛋白表达呈剂量依赖性上升，与0 μmol/L 浓度对比，Cleaved PARP在5、50、500 μmol/L 差异有统计学意义(t=4.179，P<0.05；t=8.631，P<0.01；t=9.254，P<0.01)，Bax蛋白在50、500 μmol/L差异有统计学意义(t=2.169，P<0.05；t=7.428，P<0.01)，见图1。

图1 华蟾素干预后凋亡相关蛋白表达

2.2 华蟾素干预后TE-1细胞凋亡变化 流式细胞仪检测显示，Negative Control组、Cinobufotalin组、Cinobufotalin+5-FU组、5-FU组的TE-1细胞凋亡率分别为21.32%、39.63%、59.52%、45.21%，Cinobufotalin组的TE-1细胞凋亡率高于Negative组，差异有统计学意义(t=2.236，P<0.05)；Cinobufotalin+5-FU组的TE-1细胞凋亡率高于Negative Control组、Cinobufotalin组、5-FU组，差异有统计学意义(t=11.809，P<0.01；t=4.132，P<0.05；t=3.671，P<0.05)。

2.3 华蟾素干预后TE-1细胞周期变化 与Negative Control组对比，Cinobufotalin组TE-1细胞培养48 h后细胞周期停留在G1期及G2期的比例减少，在S期的比例升高，差异有统计学意义(t=2.504，P<0.05；t=2.842，P<0.05；t=3.493，P<0.05)；与Negative Control组对比，Cinobufotalin+5-FU组TE-1细胞培养48 h后细胞周期停留在G1期及G2期的比例减少，S期的比例升高，差异有统计学意义(t=9.024，P<0.01；t=8.373，P<0.01；t=7.376，P<0.01)；与Cinobufotalin组对比，Cinobufotalin+5-FU组TE-1细胞培养48 h后细胞周期停留在G1期及G2期的比例减少，S期的比例升高，差异有统计学意义(t=4.436，P<0.05；t=3.226，P<0.05；t=3.503，P<0.05)；与5-FU组对比，Cinobufotalin+5-FU组TE-1细胞培养48 h后细胞周期停留在G1期及G2期的比例减少，S期的比例升高，差异有统计学意义(t=2.163，P<0.05；t=2.965，P<0.05；t=3.672，P<0.05)，见表1。

表1 流式细胞检测细胞周期(%)

2.4 华蟾素干预后不同培养时间TE-1细胞存活率 MTT显示，给予 Cinobufotalin 50 μmol/L干预条件下TE-1细胞培养24、48、72、96 h后，细胞存活率呈现时间依赖性下降趋势，与Negative Control组对比，Cinobufotalin组TE-1细胞培养48、72、96 h后存活率低，差异有统计学意义(t=3.029，P<0.05；t=3.176，P<0.05；t=3.992，P<0.05)；与Negative Control组对比，Cinobufotalin+5-FU组TE-1细胞培养48、72、96 h后存活率降低，差异有统计学意义(t=11.527，P<0.01；t=12.459，P<0.01；t=13.579，P<0.01)；与Cinobufotalin组对比，Cinobufotalin+5-FU组TE-1细胞培养48、72、96 h后存活率低，差异有统计学意义(t=8.236，P<0.01；t=7.932，P<0.01；t=9.19，P<0.01)；与5-FU组对比，Cinobufotalin+5-FU组TE-1细胞培养48、72、96 h后存活率低，差异有统计学意义(t=7.164，P<0.01；t=6.984，P<0.01；t=9.052，P<0.01)，见图2。

图2 MTT检测不同培养时间华蟾素处理后细胞

2.5 不同浓度华蟾素干预后TE-1细胞存活率 不同浓度梯度(0、5、10、15、20、25 μmol/L)的华蟾素作用48 h后，Cinobufotalin组及Cinobufotalin+5-FU组TE-1细胞存活率呈现剂量依赖性下降，与0 μmol/L浓度对比，Cinobufotalin组在20 μmol/L及25 μmol/L差异有统计学意义(t=2.217，P<0.05；t=3.021，P<0.05)，Cinobufotalin+5-FU组在15、20、25 μmol/L差异有统计学意义(t=3.187，P<0.05；t=5.853，P<0.01；t=7.293，P<0.01)；与Cinobufotalin组相比，Cinobufotalin+5-FU组TE-1细胞存活率在20、25 μmol/L较低，差异有统计学意义(t=2.473，P<0.05；t=3.578，P<0.05)，见图3。

图3 MTT检测不同浓度华蟾素处理后细胞存活率(培养48 h)

3 讨论

大部分食管癌患者在确诊时已经失去手术时机，以手术为基础的综合治疗在2/3的患者中不能实现[7]，放疗及化疗是目前新辅助治疗或综合治疗的主要内容，尤其对于晚期食管癌，放疗及化疗是减轻患者症状、延长患者生存期的主要治疗方式[8]。化疗药不良反应大，一部分食管癌患者对化疗敏感性差，且易发生耐药。中药治疗在食管癌方面是研究的主要方向，并取得了一定进展[9]。华蟾素提取自干蟾皮，是其中的脂溶性成分。多项研究表明，在中药中，华蟾素具有较强的抗癌疗效，用于肺癌、胃癌、子宫内膜癌及肝癌等恶性肿瘤的治疗，但目前对其抗癌机制的研究较少[10-12]。

本研究显示，华蟾素干扰后，Bcl-2/Bax通路中，Bcl-2及Survivin蛋白表达水平呈剂量依赖性下降，二者表达受到抑制，Cleaved PARP及Bax蛋白表达呈剂量依赖性上升，二者表达受到激活，表明华蟾素可能通过Bcl-2/Bax信号通路发挥对恶性肿瘤细胞的作用。Bcl-2/Bax信号通路是食管癌细胞活性过程中凋亡相关通路，Bcl-2/Bax比例对食管癌细胞凋亡具有重要影响，也是食管癌预后的标志物之一[13]，二者比例降低会导致肿瘤细胞凋亡增加，细胞存活率降低，细胞增殖活性降低。Survivin及Cleaved PARP是该信号通路的下游蛋白，直接影响肿瘤细胞的增殖及凋亡等恶性行为，Survivin是重要的促癌基因，PARP裂解为Cleaved PARP会抑制肿瘤细胞的增殖活性，促进其凋亡，是重要的抑癌基因[14]。进一步细胞实验显示，华蟾素干扰后TE-1细胞凋亡率升高，而华蟾素联合氟尿嘧啶TE-1细胞凋亡率进一步增高，明显高于华蟾素或氟尿嘧啶单药应用，细胞周期研究也显示，华蟾素及氟尿嘧啶联合应用后TE-1细胞留在G1期及G2期的比例减少，S期的比例升高，均强于二者单药应用。MTT显示，给予华蟾素干预后，TE-1细胞存活率呈现时间依赖性下降趋势，联合氟尿嘧啶后，细胞存活率呈现进一步下降趋势，均较单药应用下降明显。随着华蟾素浓度升高，联合氟尿嘧啶后细胞存活率也呈现明显下降趋势，呈现浓度依赖性。病理标本研究显示，华蟾素处理后，癌细胞表现为核破碎，组织坏死及变性，对肿瘤细胞具有杀灭作用。氟尿嘧啶是消化系统肿瘤最常用的化疗药物，在食管癌中也是化疗的首选药物之一，但其抗肿瘤作用有限，不良反应也较为常见，联合中药应用可以达到化疗增效、降低毒副作用的目的。本研究显示，华蟾素联合氟尿嘧啶应用于食管癌细胞，在促进细胞凋亡、降低细胞生存率、抑制细胞复制等方面均优于单药应用。

另有研究显示，华蟾素可提高肿瘤患者细胞免疫及体液免疫水平，提高患者自体肿瘤细胞杀灭能力。随着更多靶点的发现，靶向治疗也是食管癌治疗的主要研究方向，中药联合靶向药物治疗可能达到增强治疗效果、减轻药物毒副反应的目的。目前，化疗联合放疗是术前新辅助治疗、术后辅助治疗及晚期食管癌治疗的主要药物治疗方式，而中药联合化疗在越来越多的肿瘤治疗中心展开，并取得了重大进展，华蟾素作为近年研发的抗肿瘤作用较强的中药之一，受到很多研究者的关注。对华蟾素中抗肿瘤单剂的进一步提取是未来的研究方向。