刘 菲,薛银刚,*,屠博文,王利平*,赵亚芳,江晓栋,薛 柯

常州市春季PM2.5中细菌群落特征及影响因素

刘 菲1,薛银刚1,2*,屠博文3,王利平1*,赵亚芳2,江晓栋1,薛 柯1

(1.常州大学环境与安全工程学院,江苏 常州 213164；2.江苏省环境保护水环境生物监测重点实验室,常州市环境监测中心,江苏 常州 213001；3.常州市疾病预防控制中心,江苏 常州 213022)

为研究常州市春季PM2.5中细菌群落特征,利用高通量测序对PM2.5中细菌的16S rRNA基因进行研究.测序获得的有效序列数为600150,以97%的相似水平划分,各样品的OTUs为1890~6519,同时样本的Coverage指数较高,表明测序结果可以准确地代表样本中的空气细菌群落.物种注释结果表明:常州春季PM2.5中相对丰度>1%的有11个细菌门、14个细菌纲和12个细菌属,其中变形菌门(Proteobacteria)、蓝藻细菌门(Cyanobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)是排名前3的优势细菌类群,占总基因丰度的80.88%.属水平优势细菌主要有拟甲色球藻属(,6.03%)、(5.95%)、微囊藻属(,4.86%)和鞘氨醇单胞菌属(,3.16%),但在属水平上未能进行分类的基因序列比例高达81.11%.基于PM2.5中细菌群落组成进行来源分析,发现常州市春季PM2.5中细菌的环境来源多变,其主要环境源可能为淡水,其次是土壤、植物和人为源.利用冗余分析探讨环境因子与细菌群落的关系,结果表明,NH4+、NO3-、O3、SO42-、OC、气压和CO是常州市春季PM2.5中细菌群落的主要影响因子,同时不同环境因子对不同细菌类群影响不同.

春季；PM2.5；细菌群落；来源分析；环境因子

近年来,颗粒物已造成我国多数城市空气环境污染严重,而细颗粒物(PM2.5)是近年来大中城市灰霾天气频发的主导因素[1-2].PM2.5由于粒径小,在大气中停留时间长,传输距离远,并且由于其比表面积大,成为许多有毒有害物质的载体,对人体健康产生危害[3-4].研究表明空气中存在一定数量且具有代谢活性的微生物,细菌在近地面大气中普遍存在且为大气微生物中非常重要的一部分[5-6].目前关于PM2.5的研究大多集中于化学成分、来源分析及其对人体健康的影响[7-10],针对PM2.5中细菌群落特征及其致病性的研究相对较少,同时影响PM2.5中细菌群落结构的因素在很大程度上未知.

空气中细菌的研究方法主要有传统培养法和16S测序分析方法[5].而高通量测序技术是对传统测序技术一次革命性的改变,能够准确全面地反映细菌群落结构和多样性特征,已被广泛应用于不同生境的细菌群落及其功能研究[11-12].高通量测序技术亦是分析大气中细菌的一种有效技术,已被用于研究雾霾过程中生物气溶胶的细菌群落结构[13]和分析空气中细菌群落来源[14].

已有研究表明四季内微生物气溶胶数量以春季较高[15],所以本次研究基于Illumina HiSeq测序平台,利用16S rDNA测序方法分析常州市春季PM2.5中细菌群落结构,并基于细菌群落特征进行来源解析.利用冗余分析(RDA)研究气象因子、气态污染物和颗粒物中化学组分对PM2.5中细菌群落结构的影响,这对全面了解PM2.5中细菌的环境效应具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 样品采集

采样地点位于常州市环境监测中心东楼楼顶(119°7′47″E,31°45′44″N),是大气颗粒物自动监测国控站点,为居民文教区,采样高度距离地面10m左右.采样时间为2017年3月28日~2017年4月20日,采样期间温度逐渐回升,采样持续时间为23h (15:00~次日14:00)[16].

采样仪器为1台崂应2031型智能空气采样器(青岛崂山应用技术研究所),此采样器为大流量采样器,配PM2.5切割头,流量为1050L/min.采样所用滤膜为玻璃纤维滤膜(20.3cm×25.4cm),滤膜在采样前均使用马弗炉450℃煅烧2h,相关实验操作参照文献[10],待采样完成后将滤膜保存于-20℃,用于后续分析.

1.2 气象因子、气态污染物及化学组分监测

采样时记录气温、气压、风速和相对湿度等气象条件.SO2、O3、CO和NO2质量浓度由Thermo Scientific™ 146i多种气体校准仪(Thermo Fisher Scientific, USA)实时监测;水溶性离子(NO3-、SO42-、NH4+、Cl-、Na+、K+、Mg2+和Ca2+)质量浓度由瑞士万通中国有限公司的MARGA ADI 2080离子在线监测仪器实时监测;PM2.5和PM10质量浓度由TEOM 1405系列颗粒物监测仪(Thermo Fisher Scientific, USA)同时监测.元素碳(EC)和有机碳(OC)质量浓度由Sunset RT-4(Sunset Lab, USA)实时观测.

1.3 DNA提取

用灭菌的剪刀将样品膜剪成小的膜片(约为样品膜的1/12~1/8),再用牙签刷(灭菌)刮取样品膜上的颗粒物,并尽量减少滤膜的掺入,接着用剪刀将刮取的样品尽量剪碎后置于PowerBead Tube中,后续按PowerSoil DNA Isolation Kit(Mobio, USA)试剂盒操作标准方法提取颗粒物样品DNA.用NanoDrop2000超微量蛋白质核酸分析仪(Thermo Fisher, USA)测定提取出的DNA浓度和纯度,提取成功的样品置于-20℃中保存,用于后续的PCR扩增.

1.4 PCR扩增和荧光定量

将提取好的DNA产物使用16S V4区引物进行PCR扩增,V4区特异性引物序列正向引物: AYTGGGYDTAAAGNG,反向引物:TACNVGGGT- ATCTAATCC[17].PCR扩增见表1,总体系共计50μL. PCR扩增程序:95℃预变性3min,95℃变性30s,55℃退火温度下反应30s,72℃延伸30s,共30个循环,最后在72℃延伸5min.将样本的PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测,使用AMPure XP Beads(Beckman Coulter, USA)进行产物纯化.将PCR纯化产物用Qubit®dsDNA HS Assay Kits荧光定量系统(Life technology, USA)进行定量检测.

表1 PCR扩增体系

1.5 高通量测序

使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit(Illumina, USA)建库试剂盒进行文库构建,构建好的文库使用Qubit @ 2.0荧光计(Thermo Scientific, USA)和Agilent Bioanalyzer 2100系统(Agilent, USA)评估测序文库质量,最后在Illumina HiSeq 2500平台(Illumina, USA)上进行测序.

1.6 生物信息分析

Hiseq测序得到的配对末端读数首先根据重叠关系进行拼接,同时对序列质量进行质控和过滤,使用Uparse(v7.0.1001)软件进行序列分析,基于有效数据划分操作分类单元(OUT),按照97%相似性对非重复序列进行OTU聚类,在聚类过程中去除嵌合体,得到OTU的代表序列.筛选每个OTU的代表序列使用基于RDP分类器算法的GreenGene数据库来注释分类信息[18].为了研究不同OTU的系统发育关系,以及不同样本中优势种的差异,使用Muscle软件进行多序列比对(3.8.31版本).通过Qiime软件(Version 1.7.0)计算细菌群落Alpha多样性指数[19].

1.7 数据处理

试验数据经处理后使用Origin 2017绘制图形.环境因子与细菌群落的相关性研究首先经除趋势对应分析排序(DCA)分析,并根据分析结果中第一轴的梯度长度,选定冗余分析提取显著解释细菌群落的环境因子[20],并研究环境因子与细菌群落的相关性.

2 结果与分析

2.1 采样期间环境因子监测结果

表2 采样期间气象数据

采样期间气象数据见表2.采样期间温度为11.6~27℃;气压变化范围为1002~1021hPa;采样期间风速为0.8~2.08m/s,软风及轻风天气偏多;相对湿度平均值为55%.

各样品采样时段大气污染物演变状况见图1,除O3为8h滑动平均值外,其余污染物均为24h平均值.各污染物浓度变化范围分别为SO2(6~47μg/m3)、NO2(18~55μg/m3)、PM10(78~251μg/m3)、O3(74~ 167μg/m3)、PM2.5(36~75μg/m3)和CO(0.627~ 2.066mg/m3).

图1 采样期间气态污染物变化特征

图2 采样期间水溶性离子变化特征

各样品采集期间水溶性离子变化特征见图2,可以看出本次样品采集过程中二次颗粒物所占比重较大[21],其中NO3-、SO42-和NH4+占比重较高,NO3-变化范围为6.324~27.870μg/m3,SO42-变化范围为5.351~21.462μg/m3,NH4+变化范围为3.865~ 16.570μg/m3,3种离子平均百分比之和高达97.61%.而Cl-、Na+、K+、Mg2+和Ca2+的相对百分比较小,Cl-变化范围为1.186~2.921μg/m3,Na+变化范围为0.150~0.770μg/m3、K+变化范围为0.285~1.265μg/ m3、Mg2+变化范围为0.012~0.156μg/m3,Ca2+变化范围为0.037~0.609μg/m3.

2.2 细菌群落多样性与结构特征

经高通量测序,PM2.5样品在门、纲、目、科、属和种分类水平上获得注释信息的基因序列分别为600150、600150、593852、577204、558179和113381.在97%分类水平下,各样品的OTUs为1890~6519,反映各采样点样品OTU覆盖率的Coverage指数均达到94%以上,可以看出测序效果理想(表3).

表3 各样品OTU聚类与多样性分析

通过描述群落丰富度、多样性和均匀度的Alpha多样性指数来解释PM2.5细菌群落物种组成情况(表3).各样品细菌群落丰富度和多样性均有所差异,E样品菌群结构的多样性和均匀度较高,但细菌群落的丰富度较低,F样品菌群结构的多样性和均匀度较低,但细菌群落的丰富度较高,同时分析结果表明环境因子与Alpha多样性指数间无显著相关关系(>0.05),可能的影响因素还需进一步研究.总体来说,Chao1指数是OTU数目的2倍左右,表明本次关于细菌丰富度的测序深度约达到了多样性估计值的2倍[22].

物种注释结果表明颗粒物样品共检出20个细菌门,图3为门分类水平下PM2.5的菌群结构.相对丰度最高的是变形菌门(Proteobacteria,63.87%).4类变形菌纲为PM2.5中的优势细菌纲,其中占比较高的是α-变形菌纲(Alphaproteobacteria,23.20%)和β-变形菌纲(Betaproteobacteria,13.37%),γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria,7.57%)和δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria,3.72%)平均相对丰度较低.蓝细菌门(Cyanobacteria,11.21%)和厚壁菌门(Firmicutes,5.80%)是平均丰度排名第2和第3的优势类群;其中Cyanobacteria和Firmicutes分别在D样品和A样品相对丰度最高,分别为19.82%和9.31%.此外,相对丰度较高的细菌门依次为拟杆菌门(Bacteroidetes,3.27%)、放线菌门(Actinobacteria, 2.90%)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus, 2.05%)、疣微菌门(Verrucomicrobia,1.75%)和浮霉菌门(Planctomycetes,1.51%)和酸杆菌门(Acidobacteria, 1.12%),将占比较低的细菌类群归为Others类.

图3 PM2.5中门分类水平细菌群落组成

表4 优势细菌属丰度与来源解析

此外,平均相对丰度>1%的优势属共有12个,分别为拟甲色球藻属(,6.03%)、(5.95%)、微囊藻属(, 4.86%)、鞘氨醇单胞菌属(,3.16%)、奇异球菌属(,2.43%)、薄层杆菌属(,1.69%)、甲基杆菌属(,1.65%)、马赛菌属(, 1.61%)、副球菌属(,1.52%)、(1.46%)、假单胞菌属(,1.33%)和不动细菌属(,1.30%);优势细菌属丰度变化与来源环境见表4.

2.3 细菌群落与环境因子相关性

图4展示了气象因子、气态污染物和颗粒物化学组分对PM2.5中细菌群落的冗余分析结果,可以看出环境因子对PM2.5中细菌群落具有一定影响.经冗余分析提取显著解释细菌群落的环境因子.通过筛选,NH4+、NO3-、O3、SO42-、OC、气压(QY)和CO对细菌群落的解释量较高,分别为0.442、0.362、0.307、0.280、0.263、0.256和0.208.冗余分析结果表明第一主轴对门水平细菌群落方差变化的解释量为76.9%,第二主轴的解释量为17.6%,到轴4的累计合理解释量为98.9%.

图4 环境因子与细菌群落冗余分析

图4中各箭头连线夹角的余弦值表示二者的相关关系,可用于分析环境因子与不同物种间、环境因子间以及不同物种间的相关关系.其中,NH4+、NO3-与Cyanobacteria、Proteobacteria呈显著正相关(<0.01);SO2、气温(QW)与Bacteroidetes、Firmicutes呈显著负相关(<0.05);CO与Actinobacteria、Planctomycetes和Verrucomicrobia呈显著负相关(<0.05),与Chloroflexi、Cyanobacteria和Proteobacteria呈显著正相关(<0.05);OC、EC、气压与Bacteroidetes、Firmicutes呈显著正相关(<0.05);SO42-与Firmicutes呈显著正相关(<0.05).

3 讨论

3.1 PM2.5中细菌群落结构及来源分析

大气颗粒物中的微生物是大气环境的重要组成部分,而细菌在PM2.5已分析出的生物组分中占比高达80%以上[21];经高通量测序,常州春季PM2.5中细菌群落主要由11个细菌门、14个细菌纲和12个细菌属组成(相对丰度>1%).Fang等[30]利用FA-1型撞击式空气微生物采样器采集可培养细菌,结果表明杭州空气中可培养细菌主要为微球藻属()、芽胞杆菌属()、葡萄球菌属()、考克氏菌属()和假单胞菌属(),占总细菌种数的58%;而姚文冲[31]利用高通量测序技术研究杭州市空气细菌群落特征,发现、、和是相对含量较高的菌属;而、、和在本次研究中均有检出,相对丰度分别为0.9%、0.3%、0.2%和0.1%,占比较低.由于空气中只有大约1%的微生物能够在培养基上形成菌落,因此运用传统培养法对群落结构的判定误差较大[5].相对来说,高通量测序技术可以更加细致全貌的反映研究样品的菌群结构.本次PM2.5中大部分细菌是不致病的,但部分潜在的空气传播的病原体也被检出,如约氏不动杆菌(,0.16%)、鲁菲不动杆菌(,1.30%)[32]和盲肠肠球菌(,0.12%)[33].

来源于不同环境的细菌附着在PM2.5上,以气溶胶形式存在于城市大气环境中,是评价环境质量的重要指标.细菌在自然界的物质循环中扮演着重要角色,自然界的外在条件不仅影响着细菌气溶胶在环境空气中的比重,而且还影响着细菌群落的组成及多样性[15].PM2.5中细菌来源广泛,且可在水体、土壤和生物体之间进行交换并组成一个庞大而复杂的体系.廖旭[2]等应用T-RFLP、克隆文库等测序方法研究厦门冬季PM2.5中细菌和真核微型生物的群落组成,并分析其潜在的来源环境,结果表明厦门城区空气微生物的重要环境源可能为淡水,其次是土壤、水体沉积物、污水系统和动物粪便等.此次常州市春季PM2.5中细菌主要为Proteobacteria,这主要是由于Proteobacteria来源广泛且对大气环境有较强的适应能力,在土壤、淡水水体与大气等多种环境介质中广泛分布[34-36],同时对低温和辐射具有较强的抵抗能力[37].除Proteobacteria外,Cyanobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes主要是淡水环境中的优势细菌[38-39],同时也有研究表明淡水环境是青岛市区街道四季和人工湿地夏季空气细菌的主要来源[37],表明水体很有可能是PM2.5中细菌的最主要来源,这里的水体不仅是淡水来源,还包括天然的雨水、人为的降水以及各种污水等[40].土壤作为细菌巨大的繁殖场所和贮存体,风会把大量细菌送入空气中形成细菌气溶胶,所以土壤也是PM2.5中细菌的主要发生源[22],同时、和均为土壤环境中的优势细菌(表4).PM2.5中还检出了已知和植物相关的细菌类群,如、和(表4),表明植物源也是常州春季PM2.5中细菌的来源之一.经比较,常州春季PM2.5中细菌的主要来源环境为淡水,其次为土壤和植物,同时在样品采集过程中二次颗粒物所占的比重较大,因此人为源可能也是PM2.5中细菌的主要来源之一.

3.2 PM2.5中细菌群落结构影响因子研究

细菌在大气中存在时,会受到各种环境因子的影响,比如气候、天气变化、当地的生物来源和沙尘暴等人为和自然的污染源[41].空气中细菌的新陈代谢和生长繁殖首先会受到气温的影响;存在于大气中的气态污染物(SO2、CO和O3等)会参加一系列的物理化学反应,从而引发大气污染,会对细菌生长和存活产生影响;同时气溶胶颗粒物中存在的化学成分不仅为细菌提供粘附的媒介,也可为细菌的生长和存活提供适宜的环境[42].可见,气象因子、气态污染物和气溶胶颗粒物中化学组分共同影响着大气中细菌群落结构.

由于大气颗粒物中存在着复杂多样的组分,如有机物、元素、离子以及微生物,经冗余分析(图4)发现影响常州市春季PM2.5中细菌群落结构的主要环境因子为NH4+、NO3-、O3、SO42-、OC、气压和CO.王步英[21]发现气象因子、气态污染物和颗粒物中化学组分都会对北京冬季大气中细菌群落结构产生影响,其中温度、相对湿度、O3、NO2、颗粒物中SO42-和K+是影响细菌群落结构特征的重要环境因子.Innocente等[43]利用冗余分析研究米兰和威尼斯两个城市空气颗粒物中水溶性离子对细菌群落结构的影响,结果表明,NH4+和Ca2+与细菌群落具有很强的相关性.可见,不同地区、不同季节的环境影响因子对细菌群落结构产生不同的影响.同时也有研究[44]表明风速较大时会引起边界层的扰动,使颗粒物悬浮,从而增加大气中细菌气溶胶的浓度.经冗余分析,O3与PM2.5中大多数细菌呈负相关关系(图4),这主要是由于O3毒性和破坏性很强,对生物有机体危害极大.PM2.5中优势细菌与不同环境因子的关系均有所差异,这不仅与细菌自身特性有关,同时与环境因子的相互作用、细菌间的相关作用以及环境因子与不同细菌间的耦合关系都相关.而目前关于这方面的研究还比较缺乏,今后可开展相关研究以弥补该方面研究的空缺.

4 结论

4.1 常州春季PM2.5中细菌群落多样性和丰富度较高,相对丰度＞1%的有11个细菌门、14个细菌纲和12个细菌属,其中Proteobacteria、Cyanobacteria和Firmicutes是排名前3的优势细菌类群,占总基因丰度的80.88%.属水平优势细菌主要有(6.03%)、(5.95%)、(4.86%)和(3.16%).

4.2 常州市春季PM2.5中细菌的环境来源多变,其主要环境源可能为淡水,其次是土壤、植物和人为源.

4.3 NH4+、NO3-、O3、SO42-、OC、气压和CO是常州市春季PM2.5中细菌群落结构的主要影响因子,同时不同环境因子对不同细菌类群影响有所差异.

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Characteristics and influence factors of airborne bacterial communities in Changzhou’s PM2.5samples during spring.

LIU Fei1, XUE Yin-gang1,2*, TU Bo-wen3, WANG Li-ping1*, ZHAO Ya-fang2, JIANG Xiao-dong1, XUE Ke1

(1.School of Environmental and Safety Engineering, Changzhou University, Changzhou 213164, China；2.Key Laboratory of Environmental Protection of Water Environment Biological Monitoring of Jiangsu Province, Changzhou Environmental Monitoring Center, Changzhou 213001, China；3.Changzhou Centers for Disease Control and Prevention, Changzhou 213022, China)., 2018,38(9)：3254~3261

In order to investigate the characteristics of the airborne bacterial community in Changzhou’s PM2.5samplesduring spring, the 16S rRNA gene of bacterial in PM2.5sampleswas studied by high-throughput sequencing. 600150sequences obtained could be divided into 1890~6519 OTUs of each sample at 97% similarity level. The Coverage index of the samples was high and could accurately represent the airborne bacterial community in the samples. Species annotation results indicated that there were 11bacterial phyla, 14bacterial classes, 12bacterial genera with relative abundance greater than 1% in Changzhou’s PM2.5samples during spring. Proteobacteria, Bacteroidetes and Firmicutes were the top 3dominant phyla, accounting for 80.88% of the total gene abundance. At the genus level,(6.03%),(5.95%),(4.86%) and(3.16%) were predominant, but the proportion of gene sequences that failed to be classified was up to 81.11%. Based on the source analysis of bacterial community composition in PM2.5, it was found that the environmental sources of bacteria in Changzhou’s PM2.5samples during spring were varied, and the main environmental source might be fresh water, followed by soil, plants and anthropogenic sources. The results of redundancy analysis (RDA) for the relationship between environmental factors and bacterial community showed that NH4+, NO3-, O3, SO42-, OC, air pressure and CO were the main environmental factors affecting the bacterial community in Changzhou’s PM2.5samplesduring spring. At the same time, varied environmental factors had different effects on bacterial groups.

spring；PM2.5；bacterial community；source analysis；environmental factors

X172

A

1000-6923(2018)09-3254-08

刘 菲(1994-),女,安徽宣城人,常州大学硕士研究生,主要从事气溶胶环境效应及抗性基因污染特征研究.发表论文8篇.

2018-02-05

国家自然科学基金青年科学基金项目(21607016);常州市科技局科技支撑(社会发展)项目(CE20175022);环境基准与风险评估国家重点实验室开放课题(SKLECRA20160FP20);江苏省自然科学基金青年基金项目(BK20150250);江苏省预防医学会科研课题项目(Y2015016)

* 责任作者, 薛银刚, 高级工程师, yzxyg@126.com; 王利平, 教授, wlp@cczu.edu.cn