潘洋 张鑫源

纳米二氧化硅（nano-Si）及纳米氧化锌（nano-Fe2O3）被人们大量使用，其主要应用在纺织工业、塑料制造以及涂料等领域，因此，纳米颗粒物与人接触的概率较大。在关于纳米颗粒物的相关研究中，纳米颗粒物可以由皮肤、呼吸道、药物及肠胃等方式进入体内，随后通过参与血液和淋巴系统的循环逐步影响到身体各个器官。国内外大量有关纳米材料在毒性方面的研究表明，纳米材料可通过多种方式作用于血脑屏障，如血液循环，破坏了血脑屏障的功能，造成血脑屏障紊乱，使纳米颗粒物入侵大脑，在一定程度上影响了中枢神经系统，使神经行为产生变化[1-10]。本研究通过灌胃对Wistar大鼠进行药物干预，分别观察纳米二氧化硅和纳米氧化锌作用于大鼠时，是否会对神经行为造成改变，并进行讨论，从而证明大鼠的中枢神经系统会被这两种纳米颗粒物造成一定的损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取健康成年Wistar大鼠40只，体重160～180 g，由军事医学科学院动物中心提供，动物许可证号SCXK-（军） 2002-001。动物随机分为5组：对照组（C组）、nano-Si高剂量组（SH组）、nano-Si低剂量组（SL组）、nano-Fe2O3高剂量组（FH组）、nano-Fe2O3低剂量组（FL组），每组8只。nano-Si购于上海润河纳米研究科技有限公司，nano-Fe2O3由国家纳米中心提供，两种纳米颗粒物粒物直径大小为20～40 nm。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立 采用灌胃的方式进行药物干预，实验组给予生理盐水悬浊液及纳米颗粒物，对照组给予生理盐水，实验组在干预前进行5 min的悬浊液震荡，避免纳米颗粒物的沉积。灌胃药物的剂量分别为低剂量组给予（25 mg/kg），高剂量组给予（100 mg/kg）。进行28 d的药预，每周测量大鼠的体重变化。

1.2.2 行为学实验 （1）旷场实验：该装置是由黑色胶板制作的长方体敞箱，高50 cm，底面为边长100 cm的正方形，划分为25个等边方格。于上午8：00-10：00在安静房间内进行此试验。大鼠在中心方格内进行3 min分实验，观察大鼠3 min内后肢直立次数、大便粒数、穿越的格数、修饰次数。在每次实验测试结束后，对箱子内部进行清理，从而保障下次实验的准确度，避免下一只大鼠在测试中受到干扰，干预前及干预结束后分别测量一次。（2）Morris水迷宫实验：装置为内分4个象限的正圆小水池，直径150 cm，池中任选一个象限，在其中央放置一面积10 cm×10 cm 的正方形透明站台，隐蔽于水面下1～2 cm，水温（20±2）℃。实验中水迷宫附近参照物（包括实验人员观察时所占的方位）保持不变。定位航行试验：连续4 d，训练3次/d。将大鼠面对池壁，使其依次从其他三个非平台象限进入水中。记录逃避潜伏期，即从大鼠开始寻找平台直到爬至平台上所用时间。如果1 min后，大鼠仍不能找到平台，则实验员将其引至平台上，此时逃避潜伏期只记为60 s。大鼠爬上平台后在平台上停留20 s，两次训练间歇60 s休息时间，训练结束后迅速擦干大鼠。空间探索实验：训练第5天移除水下平台，将大鼠由任一象限放入水中，观察3 min自由游泳时间内大鼠在目的象限（原平台象限）的游泳时间。在实验干预前，对所有组别实验动物的各项行为学指标的基线值进行了测验，各组动物的行为指标相比无差异，表明各项行为指标在暴露测试前条件均衡。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件进行分析处理，计量资料采用（±s）表示，比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体重增幅比较 完成实验模型的制造后，SH组大鼠体重为（121.69±9.87）g，C组为（120.59±8.42）g，FH 组（119.87±8.69）g，SL 组（119.73±10.19）g，FL组（123.79±12.17）g，各组间大鼠的体重变化比较差异均无统计学意义（P＞0.05），表示两种纳米颗粒物并未对体重造成很大影响。

2.2 旷场实验结果比较 穿行格数旷场实验结果显示，SH、FH组与C组相比较，均明显减少，比较差异均有统计学意义（t=4.312、4.005，P＜0.05）；而低剂量两组（SL组、FL组）分别与C组进行比较，实验结果虽然有减少趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。直立次数实验结果显示，SH组、FH组与C组进行比较，直立次数明显减少，差异均有统计学意义（t=4.367、5.091，P＜0.05）；而低剂量两组（SL组、FL组）分别与C组相比，虽然有减少趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。修饰次数实验结果显示，SH组、FH组与C组相比较，差异均无统计学意义（t=0.578、0.108，P＞0.05）。大便粒数实验结果显示，SH组、FH组与C组相比较，差异均无统计学意义（t=0.441、0.487，P＞0.05）。见表1。说明两种纳米物质高剂量组对大鼠的穿行格数、直立次数有较为明显的影响，但是对修饰次数和大便粒数没有明显的影响。而低剂量组对大鼠的穿行格数、直立次数、修饰次数及大便粒数四项测试均没有明显的影响，因此说明纳米颗粒物剂量达到一定水平时，对大鼠的穿行格数及直立次数有直接的影响。

表1 各组旷场实验间结果比较（±s）

表1 各组旷场实验间结果比较（±s）

*与对照组比较，P＜0.05。

组别 穿行格数（格） 直立次数（次） 修饰次数（次） 大便粒数（粒）C 组（n=8） 79.21±21.28 13.00±3.65 2.96±0.78 2.77±0.63 SL 组（n=8） 68.58±9.66 9.70±2.93 2.39±0.74 3.14±0.97 SH 组（n=8） 44.60±8.17* 6.93±1.46* 3.17±0.67 2.94±0.89 FL 组（n=8） 64.89±9.96 9.78±1.95 2.26±0.59 2.33±0.65 FH 组（n=8） 46.60±9.05* 5.97±1.39* 3.01±1.05 2.94±0.76

2.3 水迷宫实验

2.3.1 定位航行试验 随着训练的不断增加，各组大鼠的逃避潜伏期明显缩短。实验高剂量组大鼠每天逃避潜伏期明显长于C组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；而实验低剂量组大鼠较对照组增长差异无统计学意义（P＞0.05）。通过水迷宫实验可见，大鼠在逃避潜伏期时间上，SH组与C组Day1、Day2、Day4进行比较，差异均有统计学意义（t=3.665、2.361、3.049，P＜0.05），Day3两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。FH组与C组Day1、Day2、Day4进行比较，差异均有统计学意义（t=2.402、2.12、4.185，P＜0.05），Day3两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。而SL组、FL组分别与对照组进行比较，差异均无统计续学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组水迷宫定位航行实验逃避潜伏期结果比较[s，（±s）]

表2 各组水迷宫定位航行实验逃避潜伏期结果比较[s，（±s）]

*与对照组比较，P＜0.05。

组别 Day1 Day2 Day3 Day4 C组（n=8） 29.93±4.15 10.54±5.49 6.47±2.09 2.46±0.98 SL组（n=8） 29.85±5.27 11.17±7.79 7.03±1.86 2.87±0.68 SH组（n=8） 37.16±3.73*16.59±4.73*9.41±3.52*5.79±2.93*FL组（n=8） 30.73±8.49 11.68±5.79 6.43±2.69 2.73±1.19 FH组（n=8） 38.79±9.57*17.31±7.17*9.45±5.17*6.01±2.19*

2.3.2 空间探索实验 测试目标象限游泳时间 显 示，SH 组 为（87.13±10.93）s，C组 为（103.55±17.64）s，FH 组（90.63±8.73）s，FL 组（102.04±15.74）s，SL组（99.61±9.76）s， 实 验高剂量组大鼠目标象限游泳时间明显短于C组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；而其他两组低剂量组分别与C组进行比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。因此说明两种纳米物质的剂量的高低，对大鼠目标象限游泳时间有直接的影响。

3 讨论

纳米颗粒在物理化学领域中有着其独特的作用，普遍在很多领域都有使用，人们与纳米颗粒物接触的机会较多，而纳米颗粒的安全性也越来越受到人们的关注[11]。由于人体最重要的中枢神经系统，会被纳米颗粒物视为潜在的靶器官，纳米颗粒物对神经系统造成的毒性影响值得研究[12-13]。目前国内外相关学者通过对不同粒径纳米TiO2的研究，观察其在大鼠体内的分布和毒性，实验结果发现，TiO2进入大鼠体内2周轻度地损害了大鼠的脑部，使海马神经元发生脂肪变性[14-15]。相关研究显示，给予纳米氧化铝对大鼠鼻腔进行不同剂量的滴注后，对其分别进行跳台实验、旷场试验和Morris水迷宫试验，实验结果表明，大鼠的记忆力和学习能力出现了减退，而纳米氧化铝的毒性作用很大程度上是这些退化的主要因素[17]。

为了解大鼠的焦虑情况和探索学习能力，笔者通过旷场试验观察得出了大鼠的应激、活动、兴奋性和探究性行为。研究结果表明，纳米颗粒物干预高剂量组中的大鼠探索行为能力和兴奋性均有较明显的降低，然而紧张程度却相对较高，与对照组相比，适应新环境的能力较差。在Morris水迷宫定位导航实验中，各组大鼠的逃避潜伏期时间均有所进步，这一结果表明，大鼠能够在一段时间的训练后准确地找到水下平台[18-20]。

本研究结果表明，纳米颗粒干预高剂量组大鼠与对照组大鼠相比对新环境的适应性较差，具体表现为探索行为与兴奋性降低，紧张程度则有所提高。在Morris水迷宫实验中，各组大鼠的定位航行实验中，逃避潜伏期均逐渐缩短，表明大鼠可以经过学习训练来准确地寻找到水下平台，但学习记忆能力存在明显差异。大鼠的记忆、学习能力尤其是记忆与空间学习能力通过水迷宫实验进行测验较为准确可靠。实验结果表明，大鼠通过胃灌而留存于体内的纳米颗粒物，能够对大鼠的记忆力和空间学习能力造成影响，实验过程中水迷宫实验第三天两组高剂量组的实验数据分别与对照组进行比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），由于样本量不够大，不同纳米物对大鼠造成的影响程度存在差异，是造成该结果无统计学意义的主要原因之一。

综上所述，为评价纳米颗粒物对大鼠神经行为造成的影响，对Wister大鼠进行了旷场实验以及Morris水迷宫实验，并发现剂量为100 mg/kg的纳米颗粒物可以在一定程度上损伤大鼠的神经行为。然而，由多种机制共同作用才会对神经行为造成改变。因此，纳米颗粒物作用于神经行为并使其发生改变的具体机制仍有待进一步探究。