崔莉

摘要：现有技术中阿维菌素自然选育流程耗时长、筛选效率低、设备及功能间的利用率低，因此，提供一种快速初筛方法对于阿维菌素的生产来说具有非常重要的意义。

Abstract： In the prior art， the natural selection process of Abamectin takes a long time， the screening efficiency is low， and the utilization ratio of equipment and function room is low. Therefore， it is very important to provide a rapid screening method for the production of Abamectin.

关键词：琼脂块检测筛选法；阿维菌素育种；高效育种

Key words： agar block detection and screening method；Abamectin breeding；efficient breeding

中图分类号：Q933 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2018）29-0244-02

1 研究依据

阿维菌素是由链霉菌中灰色阿佛曼链霉菌发酵产生，由一组十六元大环内酯化合物组成，是高效、广谱的抗生素类杀虫剂。目前，阿维菌素自然选育流程如下：选择出发株→制备分离平板培养基→制备单孢子悬浮液→涂布分离培养→挑单菌落接斜面→摇瓶初筛→初筛留种→接复筛斜面→摇瓶复筛→复筛留种→性状考察→高产菌种复筛留种。

现行工艺操作繁琐、周期偏长，从单菌落培养到菌种性能的初筛检测长达35天左右，其缺陷为：流程繁琐、选育周期长、工作量大、需专用设备（恒温振荡器）、能耗大、成本高、筛选效率低。因此，在菌种选育“初筛以量为主、复筛以质为主”的筛选原则下，提供一种快速初筛方法对于阿维菌素的生产来说具有非常重要的意义。

抑菌圈法又叫扩散法，成本低廉、结果准确可靠，操作便捷、简单易行，是抗生素产生菌初筛快速有效分离的筛选方法。其方法是，将待检测菌种的单菌落琼脂块移至含有试验菌的琼脂块培养基上，在适宜温湿度下培养一段时间后取出，用游标卡尺来测定各抑菌圈的直径，直径大小反映了琼脂块产抗生素能力的大小，以此判断择优选取。由于阿维菌素没有抑菌活性，其自身不能分泌抑制试验菌生长的物质或分泌某种对试验菌有毒的物质，当其转入含试验菌的培养基上就会被试验菌所抑制甚至杀灭，所以阿维菌素菌选過程中效价的检测不能采用抑菌圈法。

2 研究目的

本项目以缩短阿维菌素选育周期、提高筛选效率、节约筛选成本为研究目标，建立新的菌选方法、提高筛选效率。

3 研究内容

本项目采用琼脂块培养初筛法，过程为：生产菌种斜面培养，制备单孢子悬浮液，涂布分离培养出单菌落，挑取单菌点种于固体培养基平板上，HPLC法检测产素能力，挑取高产株摇瓶复筛，留种保藏。

4 研究方法

4.1 仪器与材料

①仪器：漩涡混合器、台式低速离心机、安捷伦高效液相色谱仪。

②材料：出发菌株（生产菌株阿佛曼链霉菌Streptomyces avermitilis），分离（斜面）培养基、点种培养基、种子摇瓶培养基、发酵摇瓶培养基；丙酮（分析纯）、甲醇（分析纯）、无水甲醇（色谱纯），有机滤膜。

4.2 培养基

4.2.1 分离（斜面）培养基（g/L）：

可溶性淀粉10、（NH4）2SO4 2.5、NaCl 0.6、MgSO4·7H2O 1.2、K2HPO4·3H2O 3.0、CaCO3 3.0、琼脂粉20；pH7.2～7.4，用蒸馏水配制，121℃灭菌30min。

4.2.2 点种培养基（g/L）：

1#——可溶性淀粉10、（NH4）2SO4 2.5、NaCl 0.6、MgSO4·7H2O 1.2、K2HPO4·3H2O 3.0、CaCO3 3.0、琼脂粉20、pH7.2～7.4，用蒸馏水配制，121℃灭菌30min。

2#——玉米淀粉70、黄豆饼粉8.0、花生饼粉10、酵母粉5.0、酵母膏4.0、CaCO3 3.0、COCl2·6H2O 0.003、淀粉酶0.0025、琼脂粉20；pH7.0～7.2，用蒸馏水配制，121℃灭菌30min。

3#——玉米淀粉70、黄豆饼粉8.0、花生饼粉10、酵母粉5.0、酵母膏3.0、玉米浆2.2、COCl2·6H2O 0.003、淀粉酶0.0025、琼脂粉20；pH7.0～7.2，用蒸馏水配制，121℃灭菌30min。

4#——玉米淀粉25、黄豆饼粉8.0、花生饼粉10、酵母粉5.0、酵母膏5.0、玉米浆4.0、COCl2·6H2O 0.003、淀粉酶0.0025、琼脂粉20；pH7.0～7.2，用蒸馏水配制，121℃灭菌30min。

4.2.3 摇瓶种子培养基（g/L）：

玉米淀粉25、黄豆饼粉8.0、花生饼粉10、酵母粉5.0、酵母膏5.0、玉米浆4.0、COCl2·6H2O 0.003、淀粉酶0.0025、pH7.0～7.2，用自来水配制，121℃灭菌30min。

4.2.4 摇瓶发酵培养基（g/L）：

玉米淀粉70、黄豆饼粉8.0、花生饼粉10、酵母粉5.0、酵母膏3.0、玉米浆2.2、COCl2·6H2O 0.003、淀粉酶0.0025、pH7.0～7.2，用自来水配制，121℃灭菌30min。

4.3 方法

4.3.1 培养方法

①分离平皿的制备：挑选生长饱满的工作细胞库斜面，加入15ml无菌水，用接种环刮取孢子，将其悬浮在无菌水中制成混合均匀的孢子悬浮液。用无菌滤纸过滤收集孢子液，并进行10-1～10-6梯度稀释，取10-5、10-6稀释液0.1～0.15ml注入于分离培养基上，用三角耙耙匀，倒置于恒温室28±1℃培养7～9天。

②点种平皿的制备：取培养至第5～7天的上述分离平板，用肉眼筛出饱满、均匀、分泌孢子量大、形态规整以及经验型产抗能力差的单菌落，在背面标记序号；并在点种培养基背面标记相应的序号（1个分离单菌落对应2个点种菌落序号；分别用3-1、3-2标示），用无菌牙签轻轻点种于相应序号位置标记处的点种培养基上，点种培养平皿倒置于恒温室28±1℃培养10～12天；分离平皿倒置于恒温室28±1℃继续培养2天左右，观察菌落的生长变化。

③斜面制备：用点种肉眼筛选方法选取优质单菌落和点种后带序号的单菌落，用接种环挑取单菌落接种于斜面培养基上，倒置于恒温室28±1℃培养7～9天。

④种子摇瓶：将培养好的斜面菌种用接种铲铲取1.0cm*1.0cm接种于种子摇瓶培养基中，28±1℃、220r/min振荡培养25～30hr，观察其菌丝生长情况。

⑤发酵摇瓶：将培养成熟的种子液按10%的接种量转接于发酵摇瓶中，28±1℃、220r/min振荡培养10天。

4.3.2 初筛

①液体摇瓶复筛：

取4.3.1⑤培养好的发酵液10ml于离心管中，3000r/min离心10min，弃去上清液。加入丙酮10ml，在漩涡混合器上振荡提取5min，静置10min，再经3000r/min离心10min得萃取液，经0.45u有机滤膜过滤，准确吸取5.0ul样品滤液进样，利用自动高效液相色谱仪检测菌株的生产能力。

②琼脂块培养初筛：

分别将两块4.3.1②培养好的、同序号点种单菌落铲下置于同一离心管中，加10ml分析纯甲醇，在漩涡混合器上充分振荡3min提取，4000r/min离心10min、静置10min后，经0.45u有机滤膜过滤，准确吸取5.0ul样品滤液进样，利用自动高效液相色谱仪检测菌株的生产能力。

5 研究结果与分析

5.1 结果

5.1.1 点种培养基优化试验结果：点种培养基设计见4.2.2。点种菌落生长情况如下：1#培养基：菌落呈馒头型、山丘型，孢子分泌量少；2#培养基：菌落呈草帽型、类草帽型，孢子分泌量多；3#培养基：菌落呈十字型、光秃型，孢子几乎无分泌；4#培养基：菌落呈光秃型、馒头型，孢子分泌量无或很少。

5.1.2 摇瓶初筛、琼脂块初筛及复筛HPLC检测结果对照（表1）

5.1.3 常规摇瓶初筛流程与改进琼脂块培养初筛流程选育周期对比：摇瓶初筛流程选育周期为26～31天；琼脂块培养初筛流程为11～13天，相对比缩短培育期15～18天。

5.2 分析

通过4批共30株菌株的点种试验，得到单菌落的表型分布有6种，分别是：草帽型、类草帽型、馒头型、十字型、光秃型、山丘型；结合表1与摇瓶复筛试验结果可得知：这6种形态的菌落其产抗能力依次为：草帽型、类草帽型、馒头型、山丘型、十字型、光秃型；从表1：摇瓶初筛与琼脂块培养初筛HPLC检测结果对照表来看，摇瓶复筛效价高的菌株其琼脂块培养初筛效价亦表现高；从表1：高产菌株复筛考察来看，点种后培养成熟的单菌落传斜面，经摇瓶考察产抗能力良好的菌株，其经菌种保藏后再次复筛验证，其仍能保持良好的初筛性能；从摇瓶初筛流程与琼脂块初筛流程选育周期对比来看，琼脂塊培养初筛选育新工艺可缩短15～18天；提高筛选效率、节约筛选成本。

6 研究结论

①琼脂块初筛选育新工艺可较传统摇瓶初筛选育周期缩短近半个月，提高筛选效率、节约筛选成本。②琼脂块初筛选育新工艺得到的菌株性能与相应的增殖斜面得到的验证结果能有效对应。③琼脂块初筛选育法筛出的的优良菌株，复筛性能稳定。

参考文献：

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[2]李燕霞，乔建军.阿维菌素B1a组分高产菌株的定向选育[J].工业微生物，2008（01）.

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