郭海燕

摘要：黑曲霉可以在四环素菌渣发酵中产生一系列酶，促进菌渣中的蛋白、纤维素、多糖等物质的分解。本研究用液体培养基培养黑曲霉种子接种于四环素菌渣发酵体系中，有效发挥了黑曲霉在菌渣处理体系中的作用，优化了处理效果，促进四环素菌渣处理规模化，减少环境污染，实现资源的循环利用，保护环境。

Abstract： Aspergillus niger can produce a series of enzymes in the fermentation of tetracycline slag， promoting the decomposition of proteins， cellulose， polysaccharides and other substances in the slag. In this study， the Aspergillus niger seeds were inoculated into the tetracycline slag fermentation system by liquid culture medium， which effectively played the role of Aspergillus niger in the slag treatment system， optimized the treatment effect， promoted the scale treatment of tetracycline slag treatment， and reduced environmental pollution， realizing the recycling of resources and protecting the environment.

關键词：黑曲霉；四环素菌渣；发酵；液体培养

Key words： Aspergillus niger；tetracycline slag；fermentation；liquid culture

中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2018）29-0238-03

0 引言

黑曲霉具有多种活性较强的酶系，如纤维素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶等，可将原料中的纤维素、蛋白质等大分子化合物降解转化为易消化利用的养分，并为酵母菌等提供必需的糖、氨基酸等营养物质，黑曲霉和酵母菌在同一个发酵体系内混种培养可以协同作用，相互促进生长，尤其酵母菌生长比较旺盛。在四环素菌渣发酵中加入黑曲霉和酵母菌混合培养，发酵效果明显好于酵母菌纯种降解菌渣，氨基氮水平高于纯种培养体系，氨基酸含量有明显升高，发酵过程中泡沫明显减少，发酵结束后发酵液具有酵母芳香气味。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

15L种子罐；50L发酵罐；高效液相色谱仪；奥林巴斯CX31拍照显微镜。

啤酒酵母冷冻液（自保藏）；

黑曲霉固体斜面孢子（自保藏）。

1.2 测定方法

1.2.1 氨基酸测定方法

高效液相色谱法

色谱条件（表1）。

色谱柱：Aglient C18柱，流动相A ：8g/L无水醋酸钠（pH7.2）-四氢呋喃-三乙胺（994：6：0.2）；流动相B：甲醇-乙腈-4g/L无水醋酸钠（pH7.2）（450：350：200）。

1.2.2 氨基氮测定方法

甲醛滴定法：称取样品5g（精确至0.002g），加水溶解定容至100mL。吸取样品溶液5.0mL于100mL烧杯中，加入55mL水，用0.05mol/L的氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH=8.20，并保持1min不变，此结果为游离酸度，不予计量体积，慢慢加入36%甲醛溶液10mL，放置1min后，用氢氧化钠标准溶液滴定至pH=9.20，记录消化氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。同时做空白试验，记录加入甲醛溶液后，空白试验所消耗氢氧化钠标准溶液滴定溶液的毫升数。

氨基氮的含量按式（1）计算，其数值以%表示。

1.3 实验方法

四环素菌渣发酵采用二级发酵方式，用种子罐分别培养黑曲霉和酵母菌，增值酵母菌数量和黑曲霉菌丝量，将一定种龄的种子液移入菌渣发酵培养基中，按一定条件培养。

①酵母菌种子液培养方法：将活化酵母种液按1-3%的接种量接种到如下培养基中：蛋白胨2.0%、酵母浸膏1.0%、葡萄糖2.0%。

培养条件：温度30-31℃，通气比1：0.5L/L/min，培养60-70hr移入菌渣培养基中。

②黑曲霉种子液液体培养方法：将黑曲霉孢子悬浮液按1-3%的接种量接种到如下培养基中：蛋白胨0.5%，磷酸二氢钾0.1%，酵母浸粉0.2%，硫酸镁0.05%，葡萄糖2.0%。

培养条件：温度34-35℃，通气比1：0.5L/L/min，培养60-70hr移入菌渣培养基中。

③酵母纯种菌渣发酵方法：将①的种子液按接种量5-10%接种到如下培养基中：四环素菌渣80-85%，葡萄糖0.5%。

培养条件：温度30℃，通气比1：0.5L/L/min，培养120hr结束培养。

④黑曲霉和啤酒酵母混种发酵方法：将①和②的种子液混合接入菌渣培养基中，接种量各5-10%，菌种培养基及培养条件同③。

2 结果与讨论

2.1 四环素菌渣中的营养物分析

四环素发酵菌渣中含有丰富的营养成分，主要为未利用完的大分子碳源氮源，如淀粉、黄豆饼粉等，还有菌丝自溶释放的营养物质，如微量元素、菌体蛋白、小分子营养物等，在四环素菌渣发酵中可以作为酵母或黑曲霉的营养物质被分解利用，而无需添加更多的营养成分。

2.2 在菌渣发酵中酵母、黑曲霉混种发酵的优势分析

2.2.1 四环素菌渣经酵母菌和黑曲霉混合发酵后，培养液有浓郁的酵母香味，显微镜镜检有大量的酵母菌，发酵料液较单独使用酵母菌发酵的料液稀薄，但酵母量明显增多，表明发酵体系中加入黑曲霉时，菌渣中的大分子淀粉、黄豆饼粉等残留物被分解利用，料液粘度较低，酵母量增值较快。

随着发酵培养基中淀粉和黄豆饼粉的残留物被分解，黑曲霉的生长逐渐减弱，速效物质被酵母菌充分利用，生长速度加快，发酵体系中酵母菌越来越多，黑曲霉逐渐由于营养物质匮乏而逐渐失去生长能力，发酵结束时发酵料液中几乎没有黑曲霉菌丝。而在酵母菌纯种培养的菌种发酵体系内，四环素碎片较多，培养基中杂质明显多于混种培养体系。

2.2.2 菌渣发酵放罐时料液中的氨基酸含量分析

菌渣发酵后氨基酸的增长是菌渣处理的关键指标，氨基酸含量越高说明菌渣的处理效果越好，氨基酸的贡献主要由酵母破壁后释放得到，考察游离氨基酸含量即可分析判断酵母生长量及四环素菌渣的分解状况。

如表3，发酵体系中接入黑曲霉发酵结束时氨基酸总和高于酵母纯种培养时的40%以上，各种氨基酸释放比较完全，氨基酸种类没有减少，发酵料液气味芳香。

2.2.3 发酵过程中的氨基氮变化规律

发酵过程的氨基氮变化规律表现了菌渣分解过程的动态平衡，在黑曲霉和酵母混合培养体系中，发酵前期随黑曲霉对大分子氮源的分解氨基氮逐渐升高，发酵中期酵母菌利用氮源繁殖生长，氨基氮上升趋势缓慢，在发酵结束时营养物质匮乏，酵母菌自溶破壁，氨基酸大量释放，氨基氮有明显的上升趋势。但在酵母菌纯种培养体系内，发酵前期氨基氮的增长缓慢，大分子氮源分解利用速度较慢，发酵结束时氨基氮水平低于混种培养，酵母菌含量明显少于混种培养。如图1。

2.3 结论

据文献报道，黑曲霉在液体发酵过程中可以分泌蛋白酶和纤维素酶，在菌渣发酵体系中黑曲霉与酵母混合培养，黑曲霉产生的纤维素酶和蛋白酶分解菌渣中的大分子碳氮源，营养物结构发酵改变，可以促进酵母菌的生长。酵母菌在混合培养体系内生长速度较快，酵母含量高，酵母破壁后可以释放大量的有机物，提高了菌渣二次发酵后的料液质量。

从以上分析结果看，菌渣发酵采用黑曲霉和啤酒酵母混种发酵时，氨基酸含量和氨基氮含量明显高于酵母纯种发酵，抽样检查发酵料液中核苷酸含量也高于纯种发酵。所以在菌渣发酵处理体系中引入黑曲霉混种发酵效果显著，发酵料液质量有明显提高，菌渣处理比较彻底，发酵后固含量残留减少，效果明显。这种处理方式，能最大程度的减少固体菌渣排放，对环境的影响作用降到了最低。而且分解处理后产生的氨基酸类物质，可循环利用作为氮源回用于发酵或做饲料，既减少了环境污染，又产生了新的效益和价值。

参考文献：

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[3]马晓建，杨君芳，常春.相应面法优化黑曲霉產木聚糖酶发酵条件的研究[J].郑州大学学报，2011，5（32）：30-33.

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