王瑾 马肖容 张王刚

[摘要] 目的 筛选CCK-8法在淋巴细胞增殖检测中的最佳实验条件。 方法 采用正交实验设计，对初始细胞浓度、培养时间、LPS浓度、显色时间这4个主要因素各水平对人外周血单个核细胞（PBMC）和小鼠脾细胞增殖的影响进行试验研究，对各实验组合测得的刺激指数进行方差分析。 结果 CCK-8检测人PBMC增殖试验的最佳条件：初始细胞浓度为2.5×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h；检测小鼠脾细胞增殖试验的最佳条件：初始细胞浓度为5.0×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h。 结论 CCK-8法便捷、灵敏、重复性好，可作为检测淋巴细胞增殖的稳定方法。本研究建立的CCK-8最佳实验条件可为免疫调节作用的药物体外筛选和免疫药理学作用的研究提供依据。

[关键词] CCK-8；PBMC；淋巴细胞增殖；正交实验

[中图分类号] R392.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（b）-0013-04

[Abstract] Objective To optimize the experimental conditions of CCK-8 in lymphocyte proliferation assays. Methods An orthogonal test was designed to investigate the influence of four major factors （cell density， culture period， concentration of LPS and duration of incubation with CCK-8） on cell proliferation of human PBMC and mouse splenocyte. ANOVA was carried out to analyze the stimulation indices of all experimental condition combinations. Results The optimal conditions for CCK-8 was as follows： for PBMC， cell density was 2.5×106/mL， culture period was 48 h， concentration of LPS was 1 μg/mL， and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h； and for splenocyte， cell density was 5.0×106/mL， culture period was 48 h， concentration of LPS was 1 μg/mL， and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h. Conclusion The optimized CCK-8 protocol is a sensitive， convenient and stable quantitative method to evaluate lymphocyte proliferation. This result can provide evidence in screening of immunomodulating drugs and investigation of their immunopharmacology.

[Key words] CCK-8； PBMC； Lymphocyte proliferation； Orthogonal test

檢测淋巴细胞增殖的方法主要有形态学检查法、放射性核素标记法和四氮唑盐比色法等。形态学检查法和放射性核素标记法因多方面原因应用有限。MTT比色法以其快速简便、灵敏度高、无放射性污染等特点，已经成为细胞生物学及相关领域分析细胞生长、活性的基本方法[1]。但其形成的甲臜结晶（Formazan）不溶于水，需加有机溶剂溶解，重复性不佳。近年来国外开发了多种水溶性的四氮唑盐类，如MTS[2]、XTT和WST-8[3-4]等。CCK-8试剂中含有的WST-8可被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臢，减少了实验步骤，提高了实验结果的准确性[5]。生成的甲臢数量与活细胞的数量成正比。用酶标仪在450 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，用于分析细胞增殖和活性[6-7]。本研究采用正交实验设计对CCK-8检测法的实验条件进行探讨，以期建立人外周血单个核细胞（human peripheral blood mononuclear cells，PBMC）和小鼠脾细胞增殖的最佳实验条件，为后期相关研究提供数据，为生物活性药物的体外筛选提供可靠的筛选体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和动物 Balb/c小鼠，雌性，6周龄，（20±2）g，购自西安交通大学医学院实验动物中心。健康人外周血，第四军医大学西京医院中国人民解放军西安血站提供。

1.1.2 试剂 CCK-8（Cell Counting Kit-8，日本Donjindo），淋巴细胞分离液（天津TBD），LPS（Sigma），96孔板（Costar），RPMI 1640培养基（Sigma）；青、链霉素（华北制药股份有限公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青）等。

1.1.3 仪器 全自动酶联免疫分析仪（德国BMG Labtechnologies公司），移液器（美国Gilson公司），CO2细胞培养箱BB16型（德国Heraeus公司），离心机LG15-W型（北京医用离心机厂），电子天平AB104-N型（梅特勒-托利多仪器有限公司），超净工作台（江苏苏净集团有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 人外周血PBMC的分离 以密度梯度离心法分离人外周血PBMC。将淋巴细胞分离液和抗凝血按照1：1的比例先后加入离心管，保持界面清晰。2000 r/min离心20 min。小心吸取血浆和淋巴细胞分离液界面处单个核细胞形成的云雾层。PBS洗涤3遍，台盼兰染色计数，细胞活力﹥95%。

1.2.2 小鼠脾细胞的分离 颈椎脱位法处死小鼠，无菌条件下取脾脏，置于盛有RPMI-1640培养液的平皿中。用眼科剪将脾脏剪成小段，置于200目不锈钢筛网上，用注射器针芯轻压使细胞通过制成脾细胞悬液，200目尼龙网过滤。台盼兰染色，细胞活力﹥95%。

1.2.3 实验设计 采用正交实验设计方法（表1）。各因素分别为：A-初始细胞浓度（×106/mL）；B-培养时间（h）；C-LPS浓度（μg/mL），D-加入CCK-8后的显色时间（h）。其中A因素有4个水平，B、C、D因素各有3个水平。用SPSS 20.0设计L16（41×33）混合正交表（表2～3），观察指标为刺激指数（SI）。按照表2的试验安排筛选CCK-8检测人PBMC增殖试验最佳条件；按照表3筛选CCK-8检测小鼠脾淋巴细胞增殖试验的最佳条件。

1.2.4 淋巴细胞增殖实验 调节人PBMC或小鼠脾淋巴细胞悬液终浓度为1×106、2.5×106、5×106、1×107/mL；将细胞悬液加至96孔板中，每孔100 μL，每组设6个平行孔；再按照试验安排加入LPS，20 μL/孔，终浓度分别为0.1、1.0、10 μg/mL，PBS为对照。每孔再加入含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液80 μL，终体积为200 μL。37℃，5%CO2，分别培养24、48、72 h。分别在在培养结束前3、4.5、6 h加入CCK-8，20 μL/孔[8]，继续培养至终点。以空白孔调零（相同培养液200 μL+CCK-8 20 μL），上机检测吸光度（A450/620），按下列公式计算刺激指数SI。上述实验重复进行3次，计算。

SI=刺激孔A值/对照孔A值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0进行统计分析，刺激指数用x±s表示。正交设计采用单变量方差分析，验证实验采用t检验进行显著性分析。

2 结果

2.1 正交实验结果

初始细胞浓度、培养时间、LPS浓度、加入CCK-8后孵育的时间4个因素对人PBMC和小鼠脾细胞增殖均有显著影响（P < 0.01）。由极差进行直观分析，在人PBMC增殖试验中，各因素的重要性顺序为C>A>B>D。通过比较各水平k值大小，各因素的最优水平为A2、B2、C2、D2，最优组合为：A2B2C2D2，即初始细胞浓度为2.5×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h是CCK-8检测人PBMC增殖试验的最佳条件，即表2中的3号试验。同理在小鼠脾细胞增殖试验中各因素对试验结果影响程度的顺序为C>A>B>D，最佳条件组合为A3B2C2D2，即初始细胞浓度为5.0×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h。但该组合并未包括在正交表中进行试验，故对该条件组合进行验证试验。见表4、5。

2.2 验证试验

A3B2C2D2组合满足试验要求（P < 0.05）。即初始细胞浓度为5.0×106/mL，培养时间为48 h，LPS浓度为1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h，是CCK-8检测小鼠脾细胞增殖实验的最佳条件。见表6。

3 讨论

淋巴细胞在丝裂原作用下的可发生增殖和分化，是机体细胞免疫应答能力的一个基本指标，广泛应用于生物活性因子的活性检测、高通量药物筛选等领域。PBMC和小鼠脾淋巴细胞是淋巴细胞增殖实验中最常用的两种细胞。检测淋巴细胞增殖的方法有形态学检查法、单细胞克隆法，检测DNA合成含量的放射性核素标记法和检测细胞代谢活性的比色法等。形态学检查法存在人工计数的主观差异，以3H-TdR掺入法为代表的放射性核素标记法比形态学检查法更客观、准确、重复性好，但存在放射性污染可能，需要特殊的仪器设备。因此，3H-TdR掺入法虽然敏感，但其应用仍然有限。而四甲基偶氮唑盐MTT比色法快速简便，灵敏度高、不需要特殊检测仪器、无放射性污染、适合大批量检测，在生物活性因子的检测[9]、细胞毒性试验[10]、抗肿瘤药物筛选[11]以及肿瘤细胞药敏检测[12]等方面广泛应用。但MTT法形成的蓝紫色甲臜结晶不溶于水，不能直接测量吸光度，要弃去上清后加二甲基亚砜溶解。由于在吸取上清液时有可能带走小部分的甲臜，影响测量结果，故重复性不佳。CCK-8法与MTT法具有相似的实验机制，而且避免了二甲基亚砜对细胞的毒性作用[11]。CCK-8试剂中含有2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐，简称为WST-8。它在电子载体1-Methoxy PMS的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为黄色甲臢产物，具高度水溶性，可直接测量，简化了实验操作步骤，重复性优于MTT法，实验结果更准确，在检测细胞增殖[14-15]、细胞毒性实验[16]、药物筛选[17]以及肿瘤药敏试验[18]中都可应用。但与MTT相比，CCK-8试剂要昂贵许多[19]。1982年Gratzer制备出抗溴脱氧尿嘧啶核苷BrdU单抗[20]。近年来非放射性标志物的研究发展迅速，标记检测技术不断改良提高，应用BrdU标记的敏感性已与3H-TdR相似[21]。目前认为BrdU是最有希望取代同位素的非放射性標志物之一。

本研究分别探讨了在人PBMC和小鼠脾淋巴细胞增殖中CCK-8检测法各自最佳的实验条件。它们最适的初始细胞浓度分别为2.5×106/mL和5.0×106/mL。最佳培养时间均为48 h。LPS浓度的研究中，1 μg/mL的浓度最适宜，浓度过低不足以刺激淋巴细胞最大程度地增殖，浓度过高（10 μg/mL）则抑制了细胞的增殖（SI<1）。关于加入CCK-8后孵育时间的长短，因血液细胞形成的甲臢很少，资料推荐较长的孵育时间（5～6 h）使显色充分。但本实验发现，当孵育时间达到6 h时空白孔吸光度增加，部分细胞数较高的孔吸光度已接近酶标仪读数的上限，影响实验的准确性。在上述细胞浓度下，显色4.5 h已经比较充分，此时空白孔吸收较小，准确度高，故实验中选择4.5 h作为最佳孵育时间。

综上所述，CCK-8检测法是一种灵敏可靠、简便快捷的方法。本研究中建立的最佳实验条件可为生物医学许多领域，如对具有免疫调节作用的药物、保健品、中草药及生物制品的体外筛选和免疫药理学作用的研究提供可靠的实验体系。

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（收稿日期：2018-05-07 本文编辑：任 念）