杨庆丽，董艳，刘玉，石杰，姬妍茹

(黑龙江省科学院 大庆分院，黑龙江 大庆 163319)

黑蒜是生大蒜在变温条件下加工生产的一种新型健康食品，成品黑蒜颜色黑亮，口味酸甜。其颜色变化的主要原因是生成了大量的类黑精。类黑精是美拉德反应过程中还原糖等的羧基与氨基酸等的游离氨基之间发生缩合生成一种棕褐色甚至黑色的大分子化合物[1]。研究表明：类黑精具有抗氧化、降糖、降血压、防龋齿等功效，其抗氧化强度甚至与目前食品中常用的抗氧化剂维生素C相媲美[2]。目前普遍认为类黑精是一类具有相似荷质比，结构非常接近的复杂混合物[3]。如刘亚玲等[4]的研究表明：咖啡类黑精成分非常复杂，最多的为棕榈酸和硬脂酸，其次是胺类、酯类、酚类、吡咯类、呋喃类、吡啶类、醛类、醇类、酮类等。类黑精的形成受较多因素的影响，反应体系的底物是其中极其重要的因素[5]。因此，本研究对黑蒜加工过程中与类黑精形成相关的还原糖、总糖、氨基酸及5-HMF变化进行分析。同时采用Py-GC-MS技术分析黑蒜类黑精组成，为美拉德反应中呈色物质的形成机理提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生大蒜：北京华联超市；5-羟甲基糠醛标准品(≥98%)：北京中科仪友化工技术研究院；DNS试剂：自配；其他试剂：均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Master-D UF实验室超纯水机 上海和泰仪器有限公司；UV765紫外可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；Epoch酶标仪 美国BioTek公司；LC-15C高效液相色谱仪 日本岛津公司；L-8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司；ISQ LT GC-MS联用仪 美国Thermo公司；台式高速冷冻离心机 上海天美科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 糖粗提液的制备

黑蒜含糖量较高、难以烘干。因此，以下试验中生大蒜及黑蒜重量为根据含水量折合后的干重。水分测定采用GB 5009.3-2010中的直接干燥法。

取不同加工时间点黑蒜样品各1 g分别加入2 mL灭菌蒸馏水，浸泡3 h后充分研磨，加入灭菌蒸馏水8 mL沸水煮20 min，80 ℃，150 W超声提取30 min，定容至10 mL，10000 r/min离心15 min后上清即为糖粗提液。

1.3.2 还原糖及总糖的测定

取糖粗提液，DNS法[6]和苯酚-硫酸法测定还原糖及总糖含量[7]，以果糖计。以等体积糖粗提液不加显色剂直接定容至刻度为本底色，酶标仪测定前所有样品反应液需9000 r/min离心15 min取上清。

1.3.3 总氨基酸的测定

黑蒜总氨基酸测定参考了董爱荣等[8]的方法；取不同加工时间黑蒜样品各100 mg研磨后加入15 mL灭菌蒸馏水，50 ℃超声30 min，加入15 mL浓HCl，氮吹仪30 min，105 ℃水解24 h。14000 r/min离心10 min，取上清3 mL于蒸发皿中，水浴蒸干后以0.02 mol/L盐酸溶解定容至10 mL。0.22 μm水膜过滤后氨基酸分析仪上样20 μL测总氨基酸量。

1.3.4 5-羟甲基糠醛(5-HMF)分析

5-HMF含量根据NY/T 1332-2007中样品处理及液相条件测定[9]。色谱柱为C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇+水(15%+85%)，流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm，柱温为室温，进样量为10 μL。标准曲线方程为y=7583x+4701，R2=0.997。

1.3.5 黑蒜类黑精的制备

根据类黑精易溶于水而不溶于乙醇的特性，本研究参考了严昊[10]的提取方法。取成品黑蒜50 g，加入150 mL灭菌蒸馏水浸泡24 h，10000 r/ min离心15 min取上清，加入2.5倍体积(V/V)的无水乙醇，10 h后弃上清，再加入约2倍体积(V/V)的无水乙醇，摇匀后二次醇沉3 h，弃上清，挥干乙醇得类黑精。

1.3.6 黑蒜类黑精Py-GC-MS分析

类黑精Py-GC-MS反应条件参考了刘亚玲等的方法。称取黑蒜类黑精0.5 mg，包裹于铁磁体的热箔片中，在450 ℃条件下裂解后进样分析。

Py条件：热裂解温度450 ℃，热裂解时间10 s。

GC条件： J & W DB-5石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；分析采用一级程序升温，初始温度60 ℃，保持5 min，以30 ℃/min的速度升至270 ℃，保持5 min；载气为氦气；流量为25 mL/min。

MS条件：电子电离源；传输线温度 270 ℃；离子源温度220 ℃；扫描时间0.2 s；质量扫描范围50～400 m/z。面积归一化法确定主要裂解产物的相对含量。

1.4 数据处理

利用Excel 2007及Graphpad Prism 5进行作图及差异显著性分析。p<0.05为差异显著，p>0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 黑蒜加工中颜色变化

图1 黑蒜加工中颜色变化Fig.1 Color changes of black garlic during processing

由图1可知，随着加工进行，黑蒜颜色逐渐加深，由1 h的乳白色变为360 h的黑色。图1中各加工时间点含水量分别为64.56%，63.66%，63.62%，68.54%，61.87%，57.62%，61.11%，48.32%，40.04%，38.49%，40.04%，37.63%。

2.2 还原糖及总糖含量

大蒜中糖含量丰富，主要是果糖、葡萄糖和半乳糖[11]，这些糖能够为黑蒜类黑精的生成提供物质基础。

图2 不同加工时间还原糖及总糖含量分析(干重)Fig.2 Analysis of reducing sugar and total sugar at different processing time (dry weight)

由图2可知，黑蒜加工过程中总糖含量在0，360 h分别为444.85，351.52 mg/g，整体呈下降趋势；其中0～24 h趋于稳定(p>0.05)；12，24，72，120 h分别为481.79，466.18，397.09，371.88 mg/g，显著下降(p<0.05)；之后保持稳定(p>0.05)。有研究表明，美拉德反应中，果糖能够与氨基酸反应生成焦糖香物质[12]。因此，总糖含量降低可能与黑蒜加工中果糖等参与美拉德反应生成了类黑精有关。还原糖含量变化总体趋势为先上升后稳定；其中0～24 h含量无显著变化(p>0.05)；24，72，120，168 h分别为23.80，42.36，48.78，62.28 mg/g，显著升高(p<0.05)；之后趋于稳定(p>0.05)；360 h显著高于0 h(p<0.05)。由以上结果可知12，24，72，120，168 h是糖变化的关键点，这些节点应该与黑蒜口味生成相关。

2.3 氨基酸组成及含量

表1 不同加工时间总氨基酸含量分析(干重)Table 1 Analysis of total amino acid content at different processing time (dry weight)

注：*为必需氨基酸。

由表1可知，黑蒜中共检测出13种氨基酸，其中4种为必需氨基酸，除组氨酸基本无变化外(p>0.05)，其他氨基酸在整个加工过程中均呈逐渐降低趋势。原因是氨基酸合成类黑精的同时加热分解生成了呋喃和吡啶等物质。其中降幅最大的为精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸(p<0.05)，分别为97.5%，85.1%，75.4%，75.1%，这几种氨基酸为参与美拉德反应的主要氨基酸。很多研究中以赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸为基础建立美拉德反应模型[13,14]。秦礼康等[15]的研究表明，形成类黑精的主要氨基酸残基是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸。由此可知，参与美拉德反应从而生成类黑精等呈香、呈色物质，可能是黑蒜加工中大多数氨基酸含量降低的主要原因。

2.4 5-HMF含量分析

5-HMF是类黑精形成的中间产物，食品加工中，美拉德反应以及糖类的受热分解都会大量产生[16]。大蒜中糖含量丰富能够为5-HMF的生成提供物质基础。

图3 5-HMF含量变化(干重)Fig.3 Changes of 5-HMF content (dry weight)

由图3可知，黑蒜加工过程中，5-HMF含量整体呈先升后降的趋势。其中0～72 h含量基本稳定；72～216 h含量显著升高(p<0.05)，分别为1.89,3.21,4.62,5.40 mg/g，之后稳中有降，360 h时为4.41 mg/g。这是由于随着加工进行5-HMF作为类黑精的中间产物，逐渐消耗生成了终产物类黑精。目前对于5-HMF的安全性仍存在争议。有研究认为，5-HMF能够造成DNA损伤[17]；有些人则认为5-HMF没有严重的健康危害，研究表明：通过各种动物实验证明5-HMF有足够大的安全限度，每天摄入量在80～100 mg/kg体重范围内无不利影响[18]。有报道称5-HMF具有抗氧化、改善血液流变学等对人体有益的生物活性[19]。另外，研究发现黑蒜中5-HMF脐静脉内皮细胞有抗炎症的作用[20]。在医药领域，以5-HMF为有效成分的心血管药物已申请相关专利[21]。因此，5-HMF的相关研究仍需继续深入进行。

2.5 黑蒜类黑精Py-GC-MS分析

黑蒜提取类黑精，通过Py-GC-MS分析，在450 ℃裂解温度条件下得到总离子流图，见图4。

图4 黑蒜类黑精裂解总离子流图Fig.4 Total ion current chromatograms of black garlic melanoidins

黑蒜类黑精热裂解产物见表2。

表2 黑蒜类黑精热裂解产物(>60.0%)Table 2 Pyrolysis products of black garlic melanoidins(>60.0%)

黑蒜类黑精裂解产物共115种，匹配度大于60%的27种，其中呋喃类11种，相对含量为46.08%；噻吩类3种，相对含量为2.42%；烷烃1种，相对含量为2.26%；吡咯类4种，相对含量为1.81%；酚类2种，相对含量为0.51%。

呋喃、吡咯及其衍生物，在大多数热加工食品中普遍存在。被认为是美拉德反应的特征产物，共同影响着热加工食品的风味[22]。还原糖在偏酸环境下会脱羟基环化生成如糠醛、糠醇、乙酰基呋喃、甲基呋喃等呋喃类产物[23]。黑蒜类黑精中含量最高的呋喃类是3-甲基呋喃、2，5-二甲基呋喃和5-羟甲基糠醛，相对含量分别为26.82%,14.59%,1.42%，黑蒜加工中还原糖含量逐渐降低，与类黑精中呋喃相对含量较高是相符的。吡咯类相对含量分别为吡咯1.03%、1-氢-3-甲基吡咯0.11%、2-乙酰基吡咯0.26%；噻吩是肉类及植物油中常见的挥发性风味物质[24]，黑蒜加工中，大蒜中硫醚化合物的不稳定键受到高温加热而断裂形成噻吩，噻吩赋予黑蒜香甜味[25]。黑精中噻吩、四氢噻吩和2-羰基三氢噻吩相对含量分别为2.01%,0.31%，0.10%。黑蒜类黑精其他组成物质包括酸类、酯类、胺类、酚类等，但相对含量都较低，在1.0%以下。

3 结论

还原糖、总糖、氨基酸和5-HMF是与类黑精形成直接相关的几种物质。随黑蒜加工的深入，各成分含量总糖降低后稳定、还原糖升高后稳定、氨基酸降低后稳定、5-HMF先升后降。类黑精成分分析中，相对含量最高的是呋喃类，其中最高的为烷基呋喃(41.39%)，其次为噻吩、烷烃、吡咯等。产生以上变化趋势的主要原因是美拉德反应中，糖加热分解以及糖和氨基酸反应均可生成5-HMF，之后5-HMF进一步转化生成烷基呋喃；还原糖脱羟基环化也可生成烷基呋喃。其他吡咯、噻吩等生成也与糖直接相关。这些物质之间的相互转化，是黑蒜的颜色与口感完全不同于生大蒜的重要原因。