邢增术 张 冲 刘振湘 白志明

(中南大学湘雅医学院附属海口医院泌尿外科，海南 海口 570208)

近年来研究发现〔1～3〕，酪氨酸激酶受体(Trk)B在某些恶性肿瘤组织中过度表达，导致肿瘤细胞的增殖能力和侵袭转移能力明显提高，但其在膀胱癌增殖转移分子机制中的具体作用国内外未见报道。本研究探讨siRNA靶向沉默TrkB基因对膀胱癌细胞株T24生长和转移的影响及其分子机制。

1 材料和方法

1.1材料 (1)细胞株：人膀胱癌T24细胞购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。(2)主要耗材及试剂：超低黏附培养板购自美国Corning 公司；人重组脑源性神经营养因子(rhBDNF)购自美国R&D公司；Lipofectamin2000购自美国Invitrogen公司；委托广州锐博生物科技有限公司设计和合成siRNAOligo；一抗和二抗均购自美国Santa Cruz 公司。

1.2细胞培养 将膀胱癌T24细胞培养于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞近90%融合时用胰蛋白酶消化传代。

1.3T24细胞的siRNA转染 TrkB(NTRK2)-siRNA1：上游5′-CCGUCACCUUGACUUGUCUTT-3′，下游5′-AGACAAGUCAAGGUGACGGTT-3′；TrkB(NTRK2)-siRNA2：上游5′-CCACGAACAGAAGUAAUGATT-3′，下游5′-UCAUUACUUCUGUUCGUGGTT-3′；TrkB(NTRK-2)-siRNA3：上游5′-GCGCUUCAGUGGUUCUAUATT-3′，下游5′-UAUAGAACCACUGAAGCGCTT-3′；阴性对照组：上游5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。按Lipofectami-n2000进行转染，转染后48 h检测目的基因蛋白，选择敲低效率最高者留作进一步实验。

1.4吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)双染色法观察细胞失巢凋亡情况 将转染TrkB-siRNA的T24细胞和阴性对照细胞(转染NT-siRNA)分别置于6孔超低黏附性培养板中与浓度为100 ng/ml 100 μl的rhBDNF共悬浮培养72 h，分别收集两组细胞制成细胞悬液。按试剂盒说明操作后荧光显微镜下观察。

1.5MTT法检测细胞生长 于细胞对数生长期，收集转染TrkB-siRNA的T24细胞和阴性对照细胞(转染NT-siRNA)，分别制成细胞悬液后接种于96孔板，每孔加入浓度为100 ng/ml 100 μl的rhBDNF共培养。于培养第0、12、24、48、72、96 h时各时间点分别收获细胞，按MTT法在酶标仪上检测各孔的OD值，绘制生长曲线。……