张晓晗， 万 甜， 程 文， 王 敏， 任杰辉

(西安理工大学 西北旱区生态水利工程国家重点实验室培育基地， 陕西 西安 710048)

1 研究背景

喹诺酮类和磺胺类抗生素均是由人工合成的抗生素，具有广谱抗菌性、强抗菌活性的特点，已广泛应用于人类疾病防治、畜禽和水产养殖业中[1-2]。研究表明，我国抗生素使用量已达到4 104 t，占世界比例的20%，而喹诺酮类以及磺胺类抗生素是使用频次最高、水体中残留量最大的两类抗生素[3]。朱琳等[4]发现北京市清河水体主要污染物质是中喹诺酮类抗生素，平均值为2238.9 ng/L。金磊等[5]发现华东地区某水源水中磺胺的检出频率为100%，浓度为43.1 ng/L。目前，有关抗生素对淡水绿藻的影响研究已经取得一定的进展。秦宏伟等[1]研究了氧氟沙星对斜生栅藻毒性作用，发现不同浓度的OFLX对斜生栅藻的生长均受到抑制且EC50值随着时间延长逐渐增大。刘滨扬[3]研究红霉素、环丙沙星和磺胺甲恶唑对羊角月牙藻的毒性效应，发现红霉素对羊角月牙藻毒性更强。

绿藻作为水生生态系统中的初级生产者[6]，是监测评价水环境质量和污染物生态毒性的重要指示生物[7]，在维持生态系统平衡和稳定状态过程中扮演者十分重要的角色[8],当这些抗生素存在于水体中时，会影响绿藻的生命代谢活动，从而影响绿藻的生长和生理活性[9]。叶绿素是评价藻类等浮游生物的生产力的重要指标，如四环素类对藻细胞中叶绿素a含量具有抑制效应，而青霉素对藻细胞叶绿素产生“低促高抑”的影响。研究表明，藻类是污染物毒性试验中理想的生物体，其生长状况以及生理生化特性的变化可以有效地反映出抗生素对它们的影响[10-11]。

本研究以蛋白小球藻、斜生栅藻两种绿藻为试验对象，分析了氧氟沙星(喹诺酮类)、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺二甲基嘧啶(磺胺类抗生素)等3种抗生素在单一及联合条件下对绿藻的敏感性，定量计算抗生素对绿藻的半抑制浓度，以期为全面认识喹诺酮类、磺胺类抗生素对绿藻的毒理作用，为抗生素类药物的生态风险评价及水体富营化提供参考价值。

2 材料与方法

2.1 试验材料

供试普通小球藻(C. vulgaris)、斜生栅藻(S. obliquus)购自中国科学院水生生物研究所，试验所用氧氟沙星(Ofloxacin，OFLX)和磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonoethoxine，SMM)两种抗生素，购自北京百灵威科技有限公司，其纯度分别大于98%、95%，磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine，SMZ)抗生素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其纯度大于99%。

2.2 藻细胞的预培养

在无菌条件下将5 mL藻种接种至10 mL BG11培养基中，于PRX-350B型智能人工气候箱中恒温光照培养至对数生长期，并进一步扩大培养。将处于对数增长期的15 mL藻种接种于装有75 mL培养基(1∶5)的锥形瓶中，培养条件为温度25 ℃，光暗比 12 h∶12 h，光照2 000 Lux静置培养，每天定时摇动3～4次，以减少藻细胞贴壁现象。培养一段时间后，镜检细胞正常，进入对数增长期开始试验。

2.3 藻类指标的测定

将处于对数增长期的普通小球藻、斜生栅藻分别接种到100 mL的锥形瓶中，试验初始藻细胞浓度为12×106个/mL，总体积90 mL，加入不同浓度梯度的抗生素(抗生素浓度见表1)。抽取 65μL(55 μL培养基+5 μL抗生素+5 μL藻液)的培养液于分光光度计(酶标仪)上测定在600 nm处的吸光度OD600，每天测定培养液的藻细胞浓度，做6组平行测定，在接种后分别观察0、24、48和96 h的吸光度OD600， 以细胞干物质重计的细胞浓度计算为：

CDW=OD600×0.4

(1)

式中：CDW为细胞干重，g/L。

表1用于敏感性试验的抗生素浓度 μg/mL

2.4 数据处理

实验数据用Origin9.1软件中非线性最小二乘拟合(NLSF)进行统计分析，单因素方法分析绿藻对不同浓度抗生素的敏感性。同时使用非线性函数模型对藻细胞第96 h生长抑制数据进行非线性拟合，进而求得各个拟合模型的相关参数。求得抗生素对藻类的半抑制浓度，定量分析抗生素对绿藻生长的影响。

3 结果与分析

3.1 单一抗生素对绿藻生长的影响

3.1.1 OFLX对绿藻生长的影响 OFLX对普通小球藻、斜生栅藻生长的影响试验结果如图1。 OFLX对普通小球藻和斜生栅藻生长均表现出“低促高抑”，在1～5 μg/mL的OFLX作用下，细胞干重大于对照组，表明绿藻的生命活性指数增加，生长状况良好，对绿藻的生长起促进作用，随着培养时间的增加，细胞干重增量越来越小，促进作用趋于平稳；反之，当OFLX浓度≥5 μg/mL时，细胞干重低于对照，对绿藻的生长起抑制作用，浓度越大，抑制作用越显著，随着培养时间的延长，细胞干重变化越来越小，抑制率下降，10 μg/mLOFLX培养后两种藻类细胞干重相比对照组分别减少了13.4%、5.8%，表明OFLX对斜生栅藻更为敏感。

图1 氧氟沙星对藻类生长的影响

绿藻在第96 h已经达到生长阶段的稳定期。故用第96 h的细胞生长数据分析抗生素抑制浓度，得到藻细胞浓度与抗生素浓度关系曲线。

拟合所得的普通小球藻对OFLX敏感性曲线表达式为：

Y=-0.0013X2+0.0105X+0.0794

(2)

(R2=99.13%)

取对照组生长量的一半Y=1/2Y=0.08057，求得半抑制浓度为，X1/2=7.96 μg/mL，即OFLX对普通小球藻的半抑制浓度为7.96 μg/mL。

拟合所得的斜生栅藻对OFLX敏感性曲线表达式为：

Y=-0.0002X2+0.0013X+0.0782

(3)

(R2=95.95%)

取对照组生长量的一半Y=1/2Y=0.07857，求得半抑制浓度为，X1/2=6.20 μg/mL，即OFLX对斜生栅的半抑制浓度为6.20 μg/mL。

分析OFLX对藻类的半抑制浓度可知，斜生栅藻对OFLX更为敏感。

3.1.2 SMM对藻类生长的影响 SMM对普通小球藻、斜生栅藻生长的影响实验结果如图2。当SMM浓度为1 μg/mL，藻类的细胞干重在整个处理期内与对照组无显著差异，说明藻类可以耐受1 μg/mL的SMM，3、5 μg/mL的SMM处理藻类其细胞干重显著高于对照组，随后增量变小，促进作用不明显，在第48 h，浓度为5 μg/mL的SMM的处理下两种藻类相比对照组增加了19.6%、27.9%，7、10 μg/mL的SMM处理细胞干重低于对照组，但始终呈增加趋势，在第72 h、7 μg/mL的SMM培养的斜生栅藻细胞干重突增，随后又显著下降，10 μg/m LSMM培养后细胞干重相比对照组分别减少了12.1%、16.9%，表明SMM对普通小球藻更为敏感；SMM对普通小球藻和斜生栅藻生长均表现出“低促高抑”。

图2 磺胺间甲氧嘧啶对藻类生长的影响

取图2中普通小球藻、斜生栅藻在第96 h的生长数据，拟合所得的普通小球藻和斜生栅藻对SMM敏感性曲线表达式分别为式(4)和式(5)。

Y=-0.0002X2+0.0011X+0.0486

(4)

(R2=91.67%)

Y=-0.0005X2+0.0036X+0.0520

(5)

(R2=91.64%)

求得SMM对普通小球藻的半抑制浓度为6.58 μg/mL；SMM对斜生栅藻的半抑制浓度为7.20 μg/mL。分析SMM对藻类的半抑制浓度可知，普通小球藻对SMM更为敏感。

3.1.3 SMZ对藻类生长的影响 SMZ对普通小球藻、斜生栅藻生长的影响实验结果如图3。1～5 μg/mL的SMZ在开始培养藻细胞的细胞干重就显著高于对照组，浓度越高，细胞干重增加越多，对藻类生长的促进作用越明显，在第24 h时5 μg/mL的SMM处理的藻类相比对照组增加了30.4%、13.0%，随着时间的延长增速趋于稳定，7～10 μg/mL 的SMZ在处理后细胞干重就开始下降，且下降程度与浓度呈正相关，从整体来看随着时间的延长细胞干重在少量增加，抗生素不仅抑制藻类生长，对藻细胞产生毒性，而且能改变其形态结构，通过藻细胞的组织结构进一步抑制藻细胞的分裂和生长繁殖；SMZ对普通小球藻和斜生栅藻生长均表现出“低促高抑”。

图3 磺胺二甲基嘧啶对藻类生长的影响

取图3中普通小球藻、斜生栅藻在第96 h的生长数据，拟合所得的普通小球藻和斜生栅藻对SMZ敏感性曲线表达式分别为公式(6)和公式(7)。

Y=-0.0004X2+0.0035X+0.0396

(6)

(R2=94.39%)

Y=-0.0003X2+0.003X+0.0407

(7)

(R2=90.55%)

求得SMZ对普通小球藻的半抑制浓度为8.19 μg/mL；SMZ对斜生栅藻的半抑制浓度为9.89 μg/mL。分析SMM对藻类的半抑制浓度可知，普通小球藻对SMZ更为敏感。

研究表明[1]OFLX对斜生栅藻的影响随着暴露浓度的增大，斜生栅藻对OFLX生长的抑制作用不断增强，藻细胞分解随着受试物浓度的增加逐渐增多。万禁禁[12]研究发现低浓度抗生素(小于1 μg/L和10 mg/L)作用下，绿藻的抗氧化系统无明显变化，高浓度抗生素作用下，绿藻抗氧化酶活性受到诱导，丙二醛含量显著增加，藻的生长受到抑制。与本实验结论相一致。

3.2 联合抗生素对绿藻生长的影响

3.2.1 两种联合抗生素(OFLX+SMM)对藻类生长的影响 OFLX+SMM抗生素对普通小球藻、斜生栅藻生长的影响实验结果如图4。由图4可看出，联合抗生素作用下，各浓度抗生素对藻细胞的细胞干重变化趋势趋与对照组相似，1、7 μg/mL 的联合抗生素对藻细胞的细胞干重相比对照组无太大变化，3、5 μg/mL 的抗生素作用下，藻细胞的细胞干重高于对照组，产生一定的促进作用，10 μg/mL的抗生素作用下，细胞干重稍有减少，产生轻微的抑制作用， OFLX+SMM对普通小球藻和斜生栅藻生长均表现出“低微促高轻抑”现象。相比单一抗生素，联合抗生素对绿藻的作用较为温和，高浓度抗生素对绿藻的抑制作用较差。

方章顺等[13]研究表明，在毒性评价中，FC-30与SCP或TMP联合时具有拮抗作用，对环境的影响小，同理，OFLX与SMM的浓度比1∶1时，其对绿藻的抑制作用较为温和，小于单一抗生素的抑制率，OFLX+SMM对普通小球藻的半抑制浓度为8.28 μg/mL，大于单一抗生素对该藻类的半抑制浓度，表现为拮抗作用；对斜生栅藻的半抑制浓度为5.71 μg/mL，表现为协同作用。

图4 氧氟沙星+磺胺间甲氧嘧啶对藻类生长的影响

取图4中普通小球藻、斜生栅藻在第96 h的生长数据，拟合所得的普通小球藻和斜生栅藻对(OFLX+SMM)敏感性曲线表达式为公式(8)和公式(9)：

Y=-0.0002X2+0.0019X+0.0483

(8)

(R2=95.84%)

Y=-0.0001X2+0.001X+0.0459

(9)

(R2=99.09%)

求得(OFLX+SMM)对普通小球藻的半抑制浓度为8.28μg/mL；(OFLX+SMM)对斜生栅藻的半抑制浓度为5.71μg/mL。分析联合抗生素对藻类的半抑制浓度可知，斜生栅藻对OFLX+SMM更为敏感。

3.2.2 3种联合抗生素(OFLX+SMM+SMZ)对藻类生长的影响 OFLX+SMM+SMZ抗生素对普通小球藻、斜生栅藻生长的影响实验结果如图5。由图5可看出，低浓度抗生素在培养初期与对照组变化趋势一致且高于对照组，对藻类生长具有良好的促进作用，随着时间的延长，联合抗生素对两种藻类的促进作用越来越大，细胞干重增加越来越快，随着抗生素浓度的增加，则产生抑制作用，细胞干重下降，且浓度越大，抑制作用越明显，相比于两种抗生素联合具有很好的协同作用， OFLX+SMM+SMZ对普通小球藻和斜生栅藻生长均表现出“低促高抑”，表现出显著地剂量-效应的关系。联合抗生素对普通小球藻的半抑制浓度为10.23 μg/mL，表现为拮抗作用，对斜生栅的半抑制浓度为7.40 μg/mL，无明显变化。

图5 OFLX+SMM+SMZ对藻类生长的影响

取图5中普通小球藻、斜生栅藻在第96 h的生长数据，拟合所得的普通小球藻和斜生栅藻对(OFLX+SMM+SMZ)敏感性曲线表达式分别为公式(10)和公式(11)：

Y=-0.0001X2+0.0009X+0.0508

(10)

(R2=97.28%)

Y=-0.0003X2+0.0022X+0.0466

(11)

(R2=95.79%)

求得联合抗生素对普通小球藻的半抑制浓度为10.23 μg/mL；联合抗生素对斜生栅藻的半抑制浓度为7.40 μg/mL。分析联合抗生素对藻类的半抑制浓度可知，斜生栅藻对OFLX+SMM+SMZ更为敏感。

4 结 论

本试验以普通小球藻和斜生栅藻为试验对象，研究了OFLX、SMM、SMZ 3种抗生素对两种绿藻的生长的影响，探讨抗生素对淡水微藻的作用机理，得出的结论为：

(1)OFLX、SMM、SMZ分别对普通小球藻的半抑制浓度分别为：7.96、6.58、8.19 μg/mL，SMM对普通小球藻的抑制力最强，敏感程度依次为：SMM>OFLX>SMZ。对斜生栅藻的半抑制浓度分别为：6.20、7.20、9.89 μg/mL，OFLX对斜生栅藻的抑制力最强，敏感程度为： OFLX>SMM>SMZ。

(2)当OFLX+SMM两种抗生素联合，抑制率小于单一抗生素，其对普通小球藻的半抑制浓度为8.28 μg/mL,表现为拮抗作用；对斜生栅藻的半抑制浓度为5.71 μg/mL，表现为协同作用。当OFLX+SMM+SMZ 3种抗生素联合，对普通小球藻的半抑制浓度为10.23 μg/mL,表现为拮抗作用；对斜生栅藻的半抑制浓度为7.40 μg/mL。

(3)单一及联合抗生素均对绿藻的生长表现为“低促高抑”。抗生素浓度小于等于5 μg/mL促进藻类的生长，浓度为5 μg/mL时促进作用最为明显。随着抗生素浓度增加，产生抑制作用，且OFLX对普通小球藻的促进作用和抑制作用均小于斜生栅藻。相反，SMM和SMZ对普通小球藻更为敏感。同OFLX一样，联合抗生素均对斜生栅藻更为敏感。