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miR-30b在肺癌细胞HCC-827侵袭中的作用及相关通路研究

2018-09-10徐峰张波张健齐泽铖徐建峰朱成楚

浙江医学 2018年15期
关键词:缓冲液载体培养基

徐峰 张波 张健 齐泽铖 徐建峰 朱成楚

肺癌是世界范围内第一大癌症疾病,其中约80%为非小细胞肺癌(NSCLC)[1]。近些年,肺癌无论在发生率还是病死率均逐年增长,与吸烟、空气环境恶化有密切关系。尽管肺癌的检测手段和手术方式不断改进,但患者的5年生存率依旧低下,仅为15%[2],在一些发展中国家,5年生存率更低。表皮生长因子受体(EGFR)广泛分布于细胞表面,对细胞的生长、增殖、分化起到关键作用,同时与肿瘤的生长、侵袭和转移有关。microRNA是一群由20~24个核苷酸构成的不具有编码功能的微小RNA,它们在肿瘤细胞增殖、分化与凋亡的过程中起着

重要作用[3-5],miR-30b在多种肿瘤中表达异常,但其在NSCLC进程中的机制尚不清楚。本研究分析miR-30b在肺癌细胞HCC-827侵袭中的作用及对相关通路的影响,现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 肺癌细胞HCC-827购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。DMEM培养基、opti-MEM培养基购自赛默飞公司。胰蛋白酶、青霉素-链霉素双抗购自上海生工公司。二甲基亚砜(DMSO);lipofectamine 2000脂质体购自美国invitrogen公司。无核酸酶水(DEPC处理水)购自北京索莱宝生物科技有限公司。TRIzol裂解液购自美国SIGMA公司。山羊抗兔抗体购自上海碧云天生物技术研究所。上样缓冲液(loading buffer)购自上海捷瑞生物工程有限公司。microRNA检测试剂盒购自上海吉玛制药有限公司。

1.2 主要方法

1.2.1 HCC-827肺癌细胞的培养 用DMEM低糖培养基(含 10%FBS、1%双抗)在细胞培养瓶中培养HCC-827肺癌细胞,置培养瓶于恒温细胞培养箱中培养。当细胞瓶底部HCC-827肺癌细胞达到90%融合度时,用细胞缓冲液PBS冲洗后加入胰蛋白酶1ml,覆盖培养瓶底部的细胞消化约3min,当显微镜下细胞变为孤立球形时,终止胰蛋白酶对细胞消化,取含细胞混合液于离心管,800r/min离心6min。弃废液,加入新培养基吹打保留的细胞沉积,充分混匀,最后将含有细胞的重悬液分配于新的培养瓶中传代。

1.2.2 HCC-827肺癌细胞的瞬时转染 将HCC-827细胞种植于6孔细胞培养板上。接种第2天,待细胞融合度达到80%时,使用lipofectamine 2000脂质体与opti-MEM培养基,参考说明书,选择细胞生长状态相近的细胞分成未转染组(不进行转染处理)、空载体组(转染空载体)、miR-30b转染组(转染miR-30b质粒),每组3个副孔,其余处理相同,放于细胞培养箱中培养。5h后将原有转染培养液更换成含血清的新鲜培养基。48h后将6孔板置于荧光显微镜下观察。

1.2.3 总RNA的提取及逆转录 首先除去6孔板中原有培养基,分别加入1ml Trizol试剂,充分裂解细胞后,将混合液至1.5ml EP管中,加入0.2ml氯仿,持续震荡,充分混匀后,室温静置2~3min。低温13 000r/min,离心12min。完毕后,取上清液0.5ml至新的EP管中。加入500μl异丙醇,轻轻摇晃,放置8min。低温13 000r/min,离心12min,弃上清液。加入1ml 75%乙醇与25%DEPC处理水的混合液,混匀,在4℃,7500r/min,5min离心后,弃乙醇,干燥10min后加DEPC水重悬,重悬液进行RNA纯度的测定。microRNA逆转录试剂盒(Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit),进行cDNA的合成。

1.2.4 逆转录PCR(RT-PCR)检测miR-30b的表达按照microRNA含量测定试剂盒的手册配制15μl的PCR反应体系,在PCR仪器上进行反应,选择U6作为内参。PCR 过程:95℃ 5min,95℃ 15s,60℃ 1min,共 40个循环。选用2-ΔΔCt法归纳分析所得到的数据。

1.2.5 Transwell侵袭实验 将Transwell小室置于细胞培养板内,加入基质胶。室温下静置20min,使基质胶于小室底部铺开,培养箱内恒温孵育3h。孵育完后,各小室内加200μl无血清培养基,水化20min。12h后,3组细胞分别取200μl加入各小室内,数目为1×105,在对应的24孔细胞培养板内(即小室外)加入500μl完全培养基。24h后取出小室,用细胞缓冲液PBS清洗2次,去除残留的细胞,完成甲醛固定后用结晶紫进行染色2h。2h后清除残余的结晶紫染料,置于显微镜下观察并保留图像,随机选择3个视野进行侵袭细胞计数。

1.2.6 Western blot实验 将3组细胞分别种植于6孔细胞培养板,各3孔。弃去多余的培养液,加细胞缓冲液PBS清洗各孔2次。完毕后,各孔加入足量的细胞裂解液,待充分裂解细胞后,刮下细胞并混匀,冰浴1h。待细胞悬液不再黏稠,4℃下,12 000r/min,离心25min,取上清液分装于EP管。将总蛋白按比例加入蛋白电泳用的上样缓冲液,100℃水浴加热 5min。保持实验条件的等同,综合所得的数据资料记录平均值,上述实验重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件,符合正态分布的计量资料以表示,3组比较采用单因素方差分析(ANOVA),两组比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组HCC-827肺癌细胞荧光显微镜下所见 见图1(插页)。

由图1可见,空载体组、miR-30b转染组可见绿色荧光,未转染组未见绿色荧光,表明空载体、miR-30b已经转染至HCC-827肺癌细胞内。

2.2 3组细胞转染后48h miR-30b相对表达量的比较 见图2。

图2 3组细胞转染后48h miR-30b相对表达量的比较

由图2可见,miR-30b转染组miR-30相对表达量为 6.97±0.42,显著高于未转染组 1.00±0.10、空载体组 1.15±0.09,差异有统计学意义(t=-24.08、-23.56,P<0.05)。未转染组和空载体组miR-30b相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 3组细胞的侵袭实验显微镜下所见及结果统计见图 3(插页)。

由图3可见,Transwell侵袭实验进行24h后,3组侵袭细胞数目比较,差异有统计学意义(F=14.79,P<0.05)。miR-30b转染组侵袭细胞的数目为157.00±10.54,与未转染组、空载体组的(195.33±10.02、192.00±7.94)比较,分别下降了19.4%,17.9%,两两比较差异有统计学意义(t=4.69、4.75,P<0.05),表明过表达 miR-30b能显著抑制HCC-827肺癌细胞的侵袭能力。

2.4 3组细胞p-EGFR、p-AKT蛋白表达的比较 见图4。

图4 3组细胞p-EGFR、p-AKT蛋白表达的比较

由图4可见,经GAPDH内参标准化后,3组p-EGFR表达量比较,差异有统计学意义(F=130.59,P<0.05)。miR-30b转染组p-EGFR表达量为0.57±0.02,与未转染组0.82±0.02、空载体组0.87±0.03比较,差异均有统计学意义(t=14.08、14.33,P<0.05)。未转染组和空载体组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3组p-AKT表达量比较,差异有统计学意义(F=2440.5,P<0.05)。miR-30b转染组p-AKT蛋白表达量为0.32±0.01,与未转染组0.66±0.01、空载体组 0.67±0.01比较,差异有统计学意义(t=60.56、66.54,P<0.05),未转染组和空载体组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

microRNA表达谱与肿瘤的临床和生物学特征相关,包括组织类型,分化,侵袭,治疗反应和预后[6],因此,自microRNA被发现以来,较早是用于各种肿瘤的鉴别诊断[7-8],亦可用于预测肿瘤患者的生存时间。越来越多证据表明这类microRNA在各种生物过程具有重要作用,研究报道其上调与下调会对细胞的增殖、生长、分化与凋亡产生影响[9-10],换言之,它们具有类似致癌或抑癌基因的功能[11]。microRNA进行基因调控的机制是它们同参与生成蛋白质的microRNA匹配,降低microRNA生成蛋白效率或其程度以抑制相关蛋白的表达[12-13],从而实现对基因的调控,均已被相关研究证实。下游靶基因受microRNA的调节通路而发挥生物学效应[14],microRNA的作用表现在调控细胞的整个生命过程,包括分化和凋亡,肿瘤细胞同样接受其调控,这些microRNA可影响肿瘤细胞的侵袭和转移能力[15]。

肺癌是较常见的恶性肿瘤之一,具有较强的侵袭和转移能力,临床上其类型大多为非小细胞型,肺癌若发生早期转移往往提示预后不良。在NSCLC中大多数均存在EGFR的突变,通常EGFR表达量升高。目前早期肺癌可采用开胸或胸腔镜下外科手术切除肿瘤,治愈率较高,是目前可行的治疗肺癌的方法,但也有一定的复发率。晚期肺癌患者有脑部或者其他器官转移将失去手术机会,而化疗带给患者诸如手脚麻木、血细胞减少、神经损伤等不良反应有时让患者难以忍受,放疗对人体正常细胞产生较大的杀伤作用,放、化疗对于NSCLC的疾病化解率约1/4和1/5。晚期肺癌临床上也可以采取靶向治疗方案[16],然而遗憾的是患者往往会产生耐药,最终的疗效不能令人满意。所以,寻找并研究其他治疗手段十分重要。

许多研究表明,多种microRNA在肺癌中存在表达异常,microRNA let-7是第一个在肺癌组织中被发现表达异常的microRNA,之后研究者陆续发现miR-126、miR-191、miR-224等microRNA在肺癌中均有表达异常。microRNAs是内源性的小片段RNA,在先天上就具有其他优势,近些年对microRNA上调及下调对肺癌的影响的研究也慢慢地成为了热点[1-2]。许多研究者试图通过改变肺癌细胞中特定microRNA的表达量来分析该中microRNA对肺癌细胞生物学特性的影响。Bai等[17]发现通过改变A549肺癌细胞中miR-196b的表达量,发现它能抑制肺癌细胞的生长和转移。Ma等[18]通过小鼠体内异种肿瘤移植实验,体外肺癌细胞实验证实miR-383对肺癌具有抑制作用。

综上所述,本研究通过将外源性携带有miR-30b基因片段的质粒导入到HCC-827肺癌细胞中,构建出过表达miR-30b的稳定细胞株,RT-PCR检测证实miR-30b转染组与未转染组、空载体组相比,miR-30b存在过表达,transwell侵袭实验证实miR-30b的过表达抑制了HCC-827肺癌细胞的侵袭能力[6]。Western blot实验检测miR-30b转染组中p-EGFR与p-AKT

的表达显著降低,表明过表达miR-30b可能通过EGFR/AKT信号通路抑制了HCC-827肺癌细胞的侵袭能力。许多研究表明多种信号通路会对肺癌起到调控作用,miR-30b通过EGFR/AKT信号通路对NSCLC的作用的机制需要进一步研究。调节microRNA表达水平,研究其对肿瘤生物学特性的改变和对相关通路的影响,为我们今后临床上克服肺癌这一难题上开启了一个新思路,为肺癌潜在的临床治愈提供了新方案。

图1 3组HCC-827肺癌细胞荧光显微镜下所见(a:未转染组;b:空载体组;c:miR-30b转染组)

图3 3组细胞侵袭实验显微镜下所见及结果统计(a:未转染组;b:空载体组;c:miR-30b转染组;d:3组细胞侵袭实验结果比较)

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