杜彩莲 张灿 袁芳 李佳颖 孙廷飞 乐扬 Shaukat Ali

摘要：【目的】分析不同溫度、pH及培养基对长毛拟青霉[Paecilomyces penicillatus（H?hn）]菌株SP053生长特性的影响，为SP053菌株的大规模发酵及微生物农药的研制与开发提供理论依据。【方法】以SP053菌株为试验材料，采用常规的固体培养方法，分别测试该菌株在6个温度梯度（17、20、23、26、29和32 ℃）、5个pH（5、6、7、8和9）和3种不同培养基[马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、萨氏培养基（SDAY）和察氏琼脂培养基（Czapek）]等培养条件下的孢子萌发率、菌落生长速率和产孢量。【结果】温度、pH和培养基类型对SP053菌株的生长特性具有明显影响。高温（32 ℃）和低温（17 ℃）均不利于SP053菌株生长，23～29 ℃为该菌株的最适生长温区，在26 ℃下的孢子萌发率（94.50%）、菌落直径（47.5 mm）和产孢量（4.450×109个孢子/皿）均最高。在26 ℃下，SP053菌株在PDA和Czapek培养基上生长较快、产孢量较多，培养15 d的菌落直径分别为47.7和46.3 mm，产孢量分别为5.357×109和2.570×109个孢子/皿。pH在7～8时SP053菌株的生长、萌发和产孢效果最佳。【结论】SP053菌株在26 ℃下、pH为7～8的PDA培养基上的生长和产孢效果最佳。

关键词： 长毛拟青霉;SP053菌株;温度;pH;培养基;生长

中图分类号： S476.12                    文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2018）12-2447-07

Effects of temperature， pH and culture media on growth and sporulation of Paecilomyces penicillatus strain SP053

DU Cai-lian1， ZHANG Can1， YUAN Fang2， LI Jia-ying2 ， SUN Ting-fei1，

YUE Yang1， Shaukat Ali1*

（1College of Agriculture， South China Agricultural University/Key Laboratory of Bio-pesticide Innovation and Application/Guangdong Engineering Technology Research Center of Pest Biocontrol， Guangzhou  510642， China;

2Yongzhou Branch， Hunan Tobacco Corporation， Yongzhou， Hunan  425000）

Abstract：【Objective】The effects of temperature， pH and culture medium on the growth characteristics of Paecilomyces penicillatus strain SP053 were examined in order to provide theoretical basis for the large-scale fermentation of microorganisms and the development of microbial pesticides. 【Method】SP053 strains were used as materials. Using common plate culture technical procedure， effects of six different temperatures（17，20，23，26，29 and 32 ℃） ， five pH levels（5，6，7，8 and 9） and three different culture media including potato dextrose agar（PDA）， SDAY， Czapek dox agar（Czapek） on the spore germination rate， colony expansion and sporulation of  SP053 were observed. 【Result】Temperature， pH and medium type had obvious influence on the growth characteristics of SP053 strain. The results showed that high temperature（32 ℃） and low temperature（17 ℃） were detrimental to the growth of SP053 strain. The optimal growth temperature ranged between 23 °C to 29 ℃ and the spore germination rate（94.50%）， colony diameter（47.5 mm） and spore production amount（4.450×109 spore/dish） were the maximum at 26 ℃. At 26 ℃， SP053 strain grew fast and produced a large amount of spores on PDA and Czapek media. On PDA and Czapek media， the colony diameters were 47.7 and 46.3 mm respectively while the spores yield were 5.357×109 and 2.570×109 spore/dish. The optimum pH for strain growth， germination and spore production ranged between 7 and 8. 【Conclusion】SP053 strain has the best growth and sporulation effect on PDA medium at 26 ℃ and pH 7-8.

Key words： Paecilomyces penicillatus; SP053 strain; temperature; pH;culture medium; growth

0 引言

【研究意义】在当前的农作物害虫防治中主要依赖化学农药（张洋，2018），但化学农药的频繁使用易导致害虫抗药性增强、生态环境污染和食品安全等系列问题。生物防治因具有对人畜、农作物及天敌安全，环境友好且不易引发害虫抗药性等特点（辛海云，2018）受到社会各界的广泛关注和推广。在害虫生物防治中，“以虫治虫，以菌治虫”的防治措施得到重视（张艳莉等，2013），其中虫生真菌对多种农林重要害虫具有很好的防治效果（王利军等，2010;李月等，2017），如应用虫生真菌淡紫拟青霉（Peacilomyces lilacinus）防治小麦禾谷包囊线虫（Heterodera avenae）（张春龙等，2014）;利用球孢白僵菌（Beauveria bassiana）防治柑橘木虱（Diaphorina citri）、西花蓟马（Frankliniella occidentalis）、松墨天牛（Monochamus alternatus）幼虫等（张璐璐等，2015;宋晓兵等，2016）;利用金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）防治螳螂和白蚁（St Leger and Wang，2010）。拟青霉属真菌是害虫生物防治中重要的虫生真菌（陈文华等，2018），其中长毛拟青霉[Paecilomyces penicillatus（H?hn）]是自然界中广泛分布的一种虫生真菌（陈宇熹等，2016），隶属于半知菌亚门（Deuteromycotina）丝孢纲（Hyphomycetes）丝孢目（Hyphomycetales）丛梗孢科（Moniliaceae）拟青霉属（Peacilomyces Bainier），具有杀虫谱广、致病力及适应性强、易于培养、孢子丰富、容易扩散等特点，在小菜蛾（Plutella xylostella）和烟粉虱（Bemisia tabaci）等害虫的生物防治中起着重要作用（蔡淑佳，2009），而对长毛拟青霉菌株培养条件的研究是应用该菌进行害虫防治的前提。【前人研究进展】真菌的生长和繁殖不仅取决于菌株本身的特性，还需要一定的环境条件和营养物质支持，温度、湿度、光照、pH、培养基等均对菌株生长起关键性作用（Hong et al.，2000;Sun et al.，2003;肖顺等，2008;彭鑫等，2016）。目前，有关拟青霉属部分真菌的培养条件已有一些报道。陈剑翔（2013）通过正交试验对细脚拟青霉的液体发酵培养基和培养条件进行筛选、优化，确定了以4%葡萄糖、2%蚕蛹粉、0.15% KH2PO4和0.15% MgSO4为成分的培养基为最佳培养基，最适宜的培养条件为温度25 ℃、pH 6.5。汪军等（2013）利用正交试验设计优化淡紫拟青霉（P. lilacinus）的固体发酵培养基，结果表明以玉米粉+甘蔗渣+麸皮+壳聚糖组成的配方为最佳复合培养基质，可产生大量分生孢子，且用量少、成本低。吴丹丹等（2015）以产孢量为指标，通过正交试验加入不同浓度的碳源、氮源，筛选出最优的玫烟色拟青霉（P. fumosoroseus）固体培养基配方为玉米粉培养基+0.2% KNO3+0.1%葡萄糖+水（1∶15=物料∶水质量比），最佳的培养条件为温度28 ℃、光照黑暗交替培养14 h∶10 h。张命龙等（2015）利用正交设计优化蝙蝠蛾拟青霉（P. hepialid）PH-2菌株液体发酵培养基及培养条件以获取高质量的菌丝体和腺苷，其最佳配方为玉米淀粉40 g/L、葡萄糖5 g/L、玉米浆25 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸锌1.5 g/L，培养条件为温度26 ℃，pH 6.0。【本研究切入点】目前鲜见有关长毛拟青霉最佳培养条件优化的文献报道。【拟解决的关键问题】采用传统的对照试验方法，以具有高毒力的长毛拟青霉菌株SP053为研究对象，观察在不同温度、pH和不同组分的培养基下该菌株的生长和繁殖特性，以期获得SP053菌株适合的培养条件，为其后期大量发酵和微生物农药的研制及开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试菌株：长毛拟青霉菌株SP053从贵州省赫章县城郊区的土壤中分离获得，保存于华南农业大学生物农药创制与应用重点实验室。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）（去皮马铃薯200 g，切成小块，加水1 L煮沸20 min，纱布过滤;加葡萄糖20 g，琼脂12～20 g，再加热使之溶化，最后定容至1 L）;萨氏培养基（SDAY）（蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，酵母粉10 g，琼脂12～20 g，蒸馏水1 L）;察氏琼脂培养基（Czapek）（NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，蔗糖30 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L）。

用NaOH和HCl调PDA培养基的pH。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 温度对SP053菌株生长和繁殖的影响

1. 2. 1. 1 温度对孢子萌发的影响 将培养好的SP053菌株配制成1.0×107个孢子/mL的悬浮液，装于灭菌的10 mL离心管中，分别置于17、20、23、26、29和32 ℃的生化培养箱内培养24 h，观察并记录孢子萌发情况，以芽管长度超过孢子直径一半作为萌发标准。每个温度梯度设置3次重复。

1. 2. 1. 2 温度对菌落生长和产孢量的影响 配制PDA培养基，灭菌后倒入直径9 cm的玻璃培养皿中，每皿15 mL，冷却，制成平板待用。将培养好的SP053菌株配制成1.0×104个孢子/mL的悬浮液，用移液枪吸取2 μL悬浮液滴于平板中央，静置一段时间后用封口膜封住培养皿边缘，分别置于17、20、23、26、29和32 ℃人工氣候箱内培养观察，光照条件为12 L∶12 D。每处理重复3次。每3 d检查并记录菌落生长直径1次，共观察15 d。

待测完最后一次菌落直径后，用100 mL 0.05% Tween-80收集孢子，计算产孢量。

1. 2. 2 培养基对菌落生长和产孢量的影响 配制PDA、SDAY和Czapek 3种培养基，灭菌后分别倒入直径为9 cm的玻璃培养皿中，每皿15 mL，冷却，制成平板待用。将培养好的SP053菌株配制成1.0×104个孢子/mL的悬浮液，用移液枪吸取2 μL悬浮液滴于平板中央，静置一段时间后用封口膜封住培养皿边缘， 置于26 ℃人工气候箱内培养。每处理重复3次。每3 d检查并记录菌落生长直径1次，共观察15 d。

待测完最后一次菌落直径后，用100 mL 0.05% Tween-80收集孢子，计算产孢量。

1. 2. 3 pH对SP053菌株生长和繁殖的影响

1. 2. 3. 1 pH对孢子萌发的影响 将PDA培养基的pH调至5、6、7、8和9，分装于10 mL离心管中。将培养好的SP053菌株配制成1.0×107个孢子/mL的悬浮液，装于灭菌的10 mL离心管中，置于26 ℃生化培养箱内培养24 h，观察并记录孢子萌发情况，以芽管长度超过孢子直径一半作为萌发标准。每处理重复3次。

1. 2. 3. 2 pH对菌落生长和产孢量的影响 将PDA培养基的pH调至5、6、7、8和9，灭菌后倒入直径为9 cm的玻璃培养皿中，每皿15 mL，冷却，制成平板待用。将培养好的SP053菌株配制成1.0×104个孢子/mL的悬浮液，用移液枪吸取2 μL悬浮液滴于平板中央，静置一段时间后用封口膜封住培养皿边缘，置于26 ℃人工气候箱内培养。每处理重复3次。每3 d检查并记录菌落生长直径1次，共观察15 d。

待测完最后一次菌落直径后，用100 mL 0.05% Tween-80收集孢子，计算产孢量。

1. 3 统计分析

利用SAS 9.0对菌落扩展量进行多重比较（Tukeys），运用Excel 2010对孢子萌发率和产孢量进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 温度对SP053菌株生长和繁殖的影响

2. 1. 1 温度对孢子萌发的影响 不同温度下SP053菌株分生孢子萌发率如图1所示。结果表明，温度对SP053菌株的分生孢子萌发率具有显著影响（P<0.05，下同），其中，26 ℃下SP053菌株的孢子萌发率最高，为94.50%，显著高于其他温度处理;其次为29和23 ℃，孢子萌发率分别为71.53%和69.12%，二者间无显著差异（P>0.05，下同）;17和32 ℃下的萌发率最低，仅为13.48%和8.16%。表明温度过高或过低均不利于SP053菌株分生孢子萌发，23～29 ℃为该菌株的最适生长温区，且26 ℃时分生孢子的萌发率最高。

2. 1. 2 温度对菌落生长和产孢量的影响 由表1可知，不同温度条件下SP053菌株的菌落生长量存在明显差异。在17、20、23、26、29和32 ℃下该菌株均能正常生长，且在17～26 ℃下的菌落生长量随温度的升高而增加，当温度继续升高时菌落生长量开始减缓。具体而言，该菌株在26 ℃下的菌落生长量增加最快，培养15 d时菌落直径达47.5 mm，且与其他温度处理达显著差异水平;其次为29和23 ℃下，培养15 d时菌落直径分别为42.1和40.1 mm，二者间无显著差异;在17 ℃下菌落生长最慢，培养15 d时菌落直径仅为25.9 mm。表明23～29 ℃最适宜SP053菌株生长，且在26 ℃下菌株生长量增加最快。

由图2可知，在17～32 ℃下SP053菌株均能产孢，其中，在26 ℃下其产孢量最高，为4.450×109個孢子/皿，且与其他温度处理达显著差异水平;其次为29 ℃，产孢量为2.082×109个孢子/皿;当温度达32 ℃时产孢量极速下降，仅为0.508×109个孢子/皿，几乎为最高产孢量的1/560，同时菌体和孢子较其他温度更易老化。表明26 ℃为SP053菌株的最佳产孢温度。

2. 2 培养基对SP053菌株生长和繁殖的影响

试验结果（表2和图3）表明，SP053菌株在PDA、SDAY和Czapek培养基上均能正常生长，其中，SP053菌株在PDA和Czapek培养基上生长较快，培养15 d的菌落直径分别为47.7和46.3 mm，二者差异不显著;在SDAY培养基上生长最慢，第3 d仍未见生长，第15 d的菌落直径为39.7 mm，显著小于在PDA和Czapek培养基上的菌落生长直径。表明PDA和Czapek培养基较SDAY培养基更适宜SP053菌株生长。

由图4可看出，SP053菌株在3种培养基上的产孢量存在显著差异，其中在PDA培养基上的产孢量显著高于其他2种培养基，达5.357×109个孢子/皿;其次为Czapek培养基，产孢量为2.570×109个孢子/皿;在SDAY培养基上的产孢量最小，仅为0.464×109个孢子/皿。因此，PDA培养基是最适宜SP053菌株产孢的培养基。

综上所述，最适合SP053菌株生长和产孢的培养基是PDA培养基，其主要的碳源为葡萄糖。

2. 3 pH对SP053菌株生长和繁殖的影响

2. 3. 1 pH对SP053菌株孢子萌发的影响 由图5可知，SP053菌株的孢子在pH为5、6、7、8和9时均能萌发，且各处理间孢子萌发率达显著差异水平，其中，pH 8时孢子萌发率最高，为97.72%，其次是pH 7时，孢子萌发率为89.57%;pH 5时孢子萌发率最低，为51.72%。

2. 3. 2 pH对菌落生长和产孢量的影响 由表3可知，SP053菌株在不同酸碱度培养基上的生长存在差异，其中在pH为7和8时生长最好，菌落直径最大，培养第15 d时的菌落直径分别为46.77和48.21 mm;培养基过酸或过碱导致菌株生长弱，菌落直径小，pH为5和9时，培养第15 d时的菌落直径分别为27.80和34.670 mm。

由图6可知，SP053菌株在不同酸碱度培养基上的产孢量存在差异显著，当pH为8时产孢量最高，为3.97×109个孢子/皿，其次是pH 7时，产孢量为3.57×109个孢子/皿，pH为5时产孢量最低，为0.84×109个孢子/皿。因此，pH 8最适合SP053菌株产孢。

3 讨论

前人研究表明，拟青霉属不同种、不同菌株的最适生长温度和营养条件有所不同。如玫烟色拟青霉孢子的最适宜萌发温度为20～28 ℃（张仙红等，2007），环链拟青霉（P. cateniannulatus）菌丝生长的最适温度为20～23 ℃，比大多数拟青霉低（朱新燕等，2008），而本研究中长毛拟青霉菌株SP053的最适宜生长温度为26 ℃。

张未仲等（2007）发现玫烟色拟青霉在培养基初始pH为6～7时菌落直径最大，产孢量最高;王瑞等（2008）研究表明，少孢节丛孢菌菌丝生长最适宜的固体培养基初始pH为7～8，以pH 7.5时菌丝的生长率最大;Dias等（2008）研究发现pH 8最适合白僵菌生长;张命龙等（2015）研究表明，拟青霉属的蝙蝠蛾拟青霉菌丝生长最适培养基初始pH为6。而本研究对象SP053菌株菌丝生长的最适培养基初始pH为7～8，表明不同真菌菌株最适宜的培养基初始pH不同，因而有必要对不同真菌菌株的最适宜培养基初始pH进行探究。

对真菌生长所用培养基的研究发现，环链拟青霉和爪哇拟青霉（P. javanicus）在PDA培养基上生长最佳且产孢最多（秦涵淳等，2008;朱新燕等，2008），与SP053菌株最适宜培养基相一致;玫烟色拟青霉则最适宜在SDAY培养基上生长（张未仲等，2007）。在科学研究中，不同类型的固体或液体培养基被广泛应用于分离菌株的培养和分生孢子的产生（Feng et al.，2000），如昆虫病理学家最常用的培养基是添加酵母提取物的SDAY培养基，此外，Czapek培养基、麦芽提取物培养基、PDA培养基和沙氏麦芽糖琼脂培养基也经常被使用。本研究结果表明，PDA为SP053菌株生长的最适宜培养基，在PDA上其菌落生长直径最大，产孢量最高。Goettel等（2000）研究发现，将马铃薯提取物加入培养基中可为真菌提供生长所需的营养物质，如淀粉、粗蛋白质、维生素和Ca、K、P、Mg、Na、S、Zn、N等矿物质。也有研究人员提出使用更复杂的培养基，如混合谷物琼脂，其特点是分离物不易失去活力，但这一说法尚未得到证实，此类培养基也尚未被广泛接受（Liu et al.，2002）。

不同培养基营养成分的差异导致其碳、氮源不同，不同真菌生长特性的差异亦导致不同培养基的适用范围不同。如球孢白僵菌、蜡蚧轮枝菌（Verticillium lecanii）、绿僵菌和莱氏野村菌（Nomuraea rileyi）最容易在标准琼脂培养基上生长和产生分生孢子，也是上述真菌商业化发展的主要优势之一（Bidochka et al.，2000;Feng et al.，2000）。对于不考虑经济因素的小规模接种生产，SDAY培养基和PDA培养基等价格相对较高的培养基已成功地诱导真菌形成分生孢子并获得几种昆虫病原真菌的接种物。大多数兼性虫生真菌可在一种或多种限定的或半限定的培养基或天然基质上生长，少数可离体培养，但需要复杂的培养基，如大链壶菌（Lagenidium gigan-teum）可在简单的培养基上培养，但需要甾醇诱导（Navon and Ascher，2000）。而SP053菌株在PDA、SDAY和Czapek培养基上均能正常生长和产生分生孢。真菌培养基的成分有碳源、氮源和其他营养物质，葡萄糖提供碳源，硝酸盐、亚硝酸盐、氨、尿素、氨基酸和其他化合物提供氮源。有研究表明，在固体培养基上，少孢节丛孢菌菌丝生长的最适碳源和氮源分别为葡萄糖和蛋白胨（王瑞等，2008）。本研究发现，SP053菌株生长的碳源为葡萄糖，与拟青霉属生长的适宜碳源相一致。

以上研究结果均表明有必要对不同真菌菌株生長繁殖所需的营养条件和环境条件进行研究，根据每个菌株特定的培养条件进行培养，得到最高的分生孢子产量，是真菌大规模生产的需要，也是害虫生物防治中以菌治虫的需要。

4 结论

23～29 ℃是SP053菌株的最适生长温区，其中26 ℃为该菌株的最适生长产孢温度，该温度下菌株萌发率高、菌落生长快、产孢最多;SP053菌株在PDA、SDAY和Czapek 3种培养基上均能正常生长和产孢，但在PDA上生长速率和产孢量均最高;pH 7～8下SP053菌株的孢子萌发率高、菌株生长快、产孢量高。

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