壮药战骨总黄酮提取物经皮给药对大鼠/小鼠的抗炎、镇痛作用研究

2018-09-10叶勇覃妮庾茜邓俊宇黄秋洁

中国药房 2018年15期

叶勇覃妮庾茜邓俊宇黄秋洁

摘要目的：研究壮药战骨总黄酮提取物经皮给药的抗炎、镇痛作用，为战骨经皮给药新制剂的研发提供参考。方法：分别将小鼠和大鼠分为空白组（40%乙醇溶液）、阳性对照组（双氯酚酸二乙胺，小鼠的给药剂量为0.390 g/kg、大鼠为0.280 g/kg）和战骨总黄酮提取物低、中、高剂量组（以生药计小鼠的给药剂量为0.400、0.791、6.330 g/kg，大鼠为0.136、0.275、2.200 g/kg）。腹部经皮给药，每天给药1次。分别采用二甲苯致炎法测定小鼠耳肿胀率（给药5 d）和弗氏完全佐剂致炎法测定致炎2、4、9、15 d后大鼠的足趾肿胀度（给药18 d），以考察战骨总黄酮提取物的抗炎作用。采用乙酸扭体法测定小鼠注射1%乙酸后20 min内的扭体次数（给药5 d），末次给药后30、60、90 min采用热板致痛法测定小鼠的疼痛抑制率（给药5 d），光热甩尾法测定大鼠的可能最大镇痛百分率（给药18 d）以及鼠尾压痛法测定小鼠的痛阈提高值（给药5 d），以综合评价战骨总黄酮提取物的镇痛作用。结果：与空白组比较，战骨总黄酮提取物高剂量组小鼠耳肿胀率和致炎不同时间后大鼠的足趾肿胀度显著降低（P<0.05或P<0.01），小鼠扭体次数显著减少（P<0.01），给药不同时间后小鼠的疼痛抑制率以及可能最大镇痛百分率和痛阈提高值均显著升高（P<0.05或P<0.01）；战骨总黄酮提取物中剂量组大鼠在致炎2、4、9 d的足趾肿胀度显著降低（P<0.05或P<0.01），小鼠扭体次数显著減少（P<0.01），末次给药后60、90 min的小鼠疼痛抑制率和痛阈提高值显著升高（P<0.05或P<0.01）；战骨总黄酮提取物低剂量组大鼠在致炎2、4、9 d的足趾肿胀度显著降低（P<0.05或P<0.01），给药后90 min的疼痛抑制率显著升高（P<0.01）。结论：战骨总黄酮提取物经皮给药具有明显的抗炎、镇痛作用，且呈现一定的量效关系。

关键词壮药；战骨总黄酮提取物；抗炎；镇痛；经皮给药；小鼠；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study anti-inflammatory and analgesic effects of total flavonoids extract of Zhuang medicine Premna fulva for rats/mice by transdermal administration， and to provide reference for R&D of new preparation extract of P. fulva by transdermal administration. METHODS： Mice and rats were divided into blank group （40% Ethanol solution）， positive control group （diclofenac diethylamine， 0.390 g/kg for mice， 0.280 g/kg for rats）， total flavonoids extract of P. fulva low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.400， 0.791， 6.330 g/kg for mice， 0.136， 0.275， 2.200 g/kg for rats， calculated by crude drug） respectively. They were given medicine by transdermal administration， once a day. Ear swelling rate of mice was determined by xylene-induced inflammation method （5 d after administration）. The inflammation method with Freunds complete adjuvant was used to determine the degree of paw edema in rats 2， 4， 9， 15 d after inducing inflammation （18 d after medication） so as to investigate anti-inflammatory effects of total flavonoids extract of P. fulva. The times of twisting in mice was determined by acetic acid-induced writhing method after injection of acetic acid in 20 min （5 d after medication） after. Inhibitory rate of pain in mice was determined by hot plate-induced pain method 30， 60， 90 min after last administration （5 d after medication）. Potential maximal analgesia percentage of rats was determined by light tail-flick method （18 d after medication）， and the improvement of pain threshold was determined in by mice tail tenderness method （5 d after medication）. Analgesic effects of total flavonoids extract of P. fulva were evaluated comprehensively. RESULTS： Compared with blank group， the ear swelling rate in mice and paw edema of rats at different time points of inflammation were decreased significantly in total flavonoids extract of P. fulva high-dose group （P<0.05 or P<0.01）， while the writhing times of mice was decreased significantly （P<0.01）； inhibitory rate of pain at different times， potential maximal analgesia percentage and the improvement of pain threshold in mice were improved significantly （P<0.05 or P<0.01）. The degree of paw edema in rats was decreased significantly 2， 4， 9 d after inducing inflammation in total flavonoids extract of P. fulva medium-dose group （P<0.05 or P<0.01）； the writhing times of mice was decreased significantly （P<0.01）； inhibitory rate of pain and the improvement of pain threshold in mice were both increased significantly 60， 90 min after last administration （P<0.05 or P<0.01）. The degree of paw edema in rats was decreased significantly 2， 4， 9 d after inducing inflammation in total flavonoids of P. fulva low-dose group （P<0.05 or P<0.01）， while inhibitory rate of pain was increased significantly 90 min after medication （P<0.01）. CONCLUSIONS： The total flavonoids extract of P. fulva by transdermal administration have significant anti-inflammatory and analgesic effect， with a dose-response relationship.

KEYWORDS Zhuang medicine； Total flavonoids extract of Premna fulva； Anti-inflammation； Analgesis； Transdermal administration； Mice； Rats

战骨为马鞭草科植物黄毛豆腐柴Premna fulva Craib的干燥茎，又名土霸王、穿云箭，壮语为“猛梦”，主产于广西西南部、贵州南部及云南南部至东南部等地，在泰国北部、老挝、越南北部至中部也有分布，全年可采。壮医认为战骨性淡、平，可祛风毒、除湿毒、通龙路、散瘀止痛、强筋健骨，多用于肥大性脊髓炎、发旺（风湿骨痛）等病症的治疗[1]。广西壮族民间常用其治疗腰腿痛、跌打损伤、风湿性关节炎、类风湿性关节炎及感冒身痛、淋巴结炎、肝区痛等症，为广西道地药材，现收载于《广西壮族自治区壮药质量标准》第一卷[1]。目前，对于战骨的研究主要集中在种质资源[2]、化学成分[3-5]、质量控制[6]、药理作用[7-10]等方面。本课题组前期研究表明，柚皮素、芹菜素等黄酮类物质可能是战骨提取物中的主要活性成分[6]，并初步探讨了其中黄酮类物质透皮吸收的可行性[11]。本研究通过经皮给药的途径对广西特色壮药战骨有效部位——总黄酮的抗炎、镇痛活性进行初步探讨，以期对战骨经皮给药新制剂的研发提供参考。

1 材料

1.1 仪器

YLS-3E型电子压痛仪（济南益延科技发展有限公司）；R-1001N型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；BS2245型分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）； SW-200型光热尾痛仪、RB-200型智能热板仪（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

战骨药材购于广西壮族自治区宜州市，经广西中医药大学傅鹏副教授鉴定为马鞭草科豆腐柴属植物黄毛豆腐柴的茎；战骨总黄酮提取物为广西医科大学药剂学实验室提供（批号：20150926），其中总黄酮含量约为35%；双氯酚酸二乙胺乳胶剂[北京诺华制药有限公司，批号：X1511，规格：20 g ∶ 0.2 g（以双氯芬酸钠计）]；弗氏完全佐剂（美国Sigma公司）；其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 动物

清洁级KM小鼠230只[♀♂兼用，体质量（20±2） g]和Wistar大鼠80只[♂，体质量（200±20） g]均购自广西医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（桂）2014-0002。实验前24 h，给大、小鼠腹部脱毛，大鼠脱毛面积为3 cm×3 cm、小鼠为2 cm×2 cm，作为给药部位。

2 方法

2.1 战骨总黄酮提取物的制备

精密称取战骨药材细粉250 g，加入10倍量80%乙醇回流提取2次，每次1 h，提取液浓缩至膏状，经D101大孔树脂柱上样，先用蒸馏水洗脱至无色，再用3倍柱体积40%乙醇洗脱，收集合并乙醇洗脱液，调整洗脱液pH为5左右，减压回收乙醇，真空干燥，即得。

2.2 战骨总黄酮提取物溶液的制备

大鼠用药：分别称取战骨总黄酮提取物适量，置于50 mL量瓶中，用40%乙醇溶液溶解并稀释至刻度，作为中剂量（以生药量计为0.275 g/kg），高、低剂量分别为中剂量的8、0.5倍（即以生药量计分别为2.200、0.136 g/kg）。小鼠用药：分别称取战骨总黄酮提取物适量，置于50 mL量瓶中，用40%乙醇溶液溶解并稀释至刻度，作为中剂量（以生药量计为0.791 g/kg），高、低剂量分别为中剂量的8、0.5倍（以生药量计分别为6.330、0.400 g/kg）。

2.3 抗炎作用实验

2.3.1 战骨总黄酮提取物对二甲苯致炎小鼠耳肿胀的影响取小鼠50只（♂）随机分为空白组、阳性对照组和战骨总黄酮提取物低、中、高剂量组，每组10只。阳性对照组小鼠按0.390 g/kg涂抹双氯酚酸二乙胺乳胶剂[12]，战骨总黄酮提取物组小鼠按“2.2”项下剂量涂抹相应药液0.01 mL/g，空白组小鼠涂抹40%乙醇溶液0.01 mL/g。每日给药1次，连续给药5 d。末次给药30 min后，于小鼠右耳前后两面各涂抹二甲苯20 μL，30 min后脱臼处死小鼠，剪下双耳，用打孔器（直径8 mm）在剪下的双耳中央处打孔，立即称定耳片质量（mg），并计算耳肿胀度[耳肿胀度（mg）=右耳质量-左耳质量]，进一步计算耳肿胀率[（耳肿胀率（%）=右耳质量-左耳质量）/右耳质量×100%]和耳肿胀抑制率[耳肿胀抑制率（%）=空白组耳肿胀度-给药组耳肿胀度）/空白组耳肿胀度×100%]。

2.3.2 战骨总黄酮提取物对大鼠佐劑性关节炎的影响取大鼠30只（♂）随机分为空白组、阳性对照组和战骨总黄酮提取物高、中、低剂量组，每组6只。阳性对照组大鼠于脱毛区涂抹双氯酚酸二乙胺乳胶剂0.280 g/kg[12]，战骨总黄酮提取物组大鼠按“2.2”项下剂量涂抹相应药液0.002 mL/g，空白组大鼠涂抹40%乙醇溶液0.002 mL/g。每日给药1次，连续给药18 d。第3天给药30 min后，于每鼠右后足跖内注射弗氏完全佐剂0.05 mL致炎。在致炎前24 h和致炎后第2、4、9、15天分别测量大鼠右后足跖的体积（mL），计算各组大鼠的足趾肿胀度[足趾肿胀度（mL）=（致炎后足趾体积-致炎前足趾体积）/致炎前足趾体积×100%]。并从致炎后第9天开始，观察各组大鼠前肢、耳和尾部病变情况。

2.4 镇痛实验

2.4.1 战骨总黄酮提取物对乙酸引起小鼠扭体反应的影响取小鼠50只（♂）按“2.3.1”项下方法分组、给药。末次给药后30 min，腹腔注射1%乙酸溶液0.02 mL/g，观察并记录注射乙酸后20 min内各组小鼠的扭体次数。

2.4.2 战骨总黄酮提取物对热板刺激引起小鼠疼痛反应的影响调热板仪控制温度在（55.0±0.5） ℃，将80只小鼠置于智能热板仪中，启动电子计时器，以小鼠舔后足为疼痛反应指标，观察小鼠出现舔后足所需时间（s）作为该鼠痛阈值，凡舔足时间小于5 s或大于30 s者弃之不用。将筛选出的50只小鼠按“2.3.1”项下方法分组、给药。于末次给药后30、60、90 min，分别以热板法测量各组小鼠的痛阈值，如60 s后仍无反应，将小鼠取出，以免烫伤，其痛阈值以60 s计。根据公式计算给药不同时间后各组小鼠的疼痛抑制率[疼痛抑制率（%）=（给药后痛阈值-给药前痛阈值）/给药前痛阈值×100%]。

2.4.3 战骨总黄酮提取物对大鼠光热甩尾反应的影响取50只大鼠，将大鼠尾部距尖端1.5 cm处内侧皮肤置于热辐射测痛仪辐射点上，以大鼠尾端皮肤接受热辐射刺激到其自动从刺激点甩开的时间（s）为基础痛阈，选择基础痛阈大于2 s并小于10 s的大鼠用于实验。将筛选合格的30只大鼠（♂）按 “2.3.2”项下方法分组、给药。末次给药30 min后，按上述方法测定各组大鼠的痛阈值，以60 s不甩开辐射点为镇痛百分之百，以给药前、后自身比较计算可能最大镇痛百分率[可能最大镇痛百分率（%）=（给药后痛阈值-给药前痛阈值）/给药前痛阈值×100%]。

2.4.4 战骨总黄酮提取物对小鼠鼠尾压痛反应的影响将50只小鼠（♀）按“2.3.1”项下方法分组、给药。末次给药30 min后，将小鼠置于固定器内，尾部暴露在固定器外，待小鼠安静后进行实验。测定前在小鼠尾部1/3处作为施压点进行标记，施压时以小鼠出现挣扎或嘶叫作为疼痛反应指标，记录此压力值（g），即为该鼠痛阈值。重复测定时，支撑点可稍作移动，以免压伤组织。以给药后的痛阈提高值（给药后痛阈值-给药前痛阈值）为测定指标。

2.5 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据处理。数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，再以LSD法进行组间两两比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 抗炎实验结果

3.1.1 战骨总黄酮提取物对二甲苯致炎小鼠耳肿胀的影响结果与空白组比较，战骨总黄酮提取物高剂量组和阳性对照组小鼠耳肿胀率显著降低（P<0.01），其余各组差异无统计学意义（P>0.05）。与阳性对照组比较，战骨总黄酮提取物高剂量组小鼠耳肿胀率显著降低、耳肿胀抑制率显著升高（P<0.05）。各组小鼠耳肿胀率和耳肿胀抑制率测定结果见表1。

3.1.2 战骨总黄酮提取物对大鼠佐剂性关节炎的影响结果致炎后24 h，空白组大鼠右后足跖明显肿胀，其后4 d内足肿胀无明显变化；致炎9 d后足跖肿胀度有升高趋势，但在致炎15 d后明显好转。在致炎后2、4 d，阳性对照组和战骨总黄酮提取物各剂量组大鼠的足跖肿胀程度显著低于空白组（P<0.05或P<0.01），且战骨总黄酮提取物高剂量组大鼠在致炎后2、4 d的足跖肿胀度均显著低于阳性对照组（P<0.05或P<0.01）；在致炎后9 d，各组大鼠的足跖再度明显肿胀，并因迟发型超敏反应引起继发性病变，表现为耳和尾部出现“关节炎”小结节等，但各给药组大鼠的足跖肿胀度仍显著低于空白组（P<0.05或P<0.01），且战骨总黄酮提取物各剂量组大鼠的足跖肿胀度均显著低于阳性对照组（P<0.05或P<0.01）。在致炎后15 d，战骨总黄酮提取物高剂量组和阳性对照组大鼠足跖肿胀度显著低于空白组（P<0.05），同时其他继发性症状也明显减轻，但战骨总黄酮提取物中、低剂量组大鼠足跖肿胀度显著高于阳性对照组（P<0.05）。各组大鼠致炎不同时间后的足跖肿胀度测定结果见表2。

3.2 镇痛实验结果

3.2.1 战骨总黄酮提取物对乙酸引起小鼠扭体反应的影响结果空白组小鼠在末次腹腔注射乙酸后，20 min内的扭体次数为（38.00±3.27）次，阳性对照组和战骨总黄酮提取物高、中剂量组小鼠20 min内的扭体次数分别为（23.80±7.67）、（18.30±9.06）、（23.00±5.48）次，与空白组比较显著减少（P<0.01）；战骨总黄酮提取物低剂量组小鼠20 min的扭体次数为（34.40±6.13）次，与空白组比较差异无统计学意义（P>0.05）。战骨总黄酮提取物各剂量组小鼠20 min内的扭体次数较阳性对照组差异均无统计学意义（P>0.05）。

3.2.2 战骨总黄酮提取物对热板刺激引起小鼠疼痛反应的影响结果在给药后30、60、90 min，各给药组小鼠的疼痛抑制率较空白组均不同程度升高，其中战骨总黄酮提取物高剂量组和阳性对照组小鼠在给药后30 min的疼痛抑制率显著升高（P<0.05或P<0.01），且战骨总黄酮提取物高剂量组显著高于阳性对照组（P<0.01）；战骨总黄酮提取物高、中剂量组和阳性对照组小鼠在给药后60 min的疼痛抑制率显著升高（P<0.05或P<0.01），且战骨总黄酮提取物高剂量组显著高于阳性对照组（P<0.05）；各给药组小鼠在给药90 min的疼痛抑制率均显著高于空白组（P<0.01），且战骨总黄酮提取物高剂量组显著高于阳性对照组（P<0.01）。给药不同时间后各组小鼠的疼痛抑制率测定结果见表3。

3.2.3 战骨总黄酮提取物对大鼠光热甩尾反应的影响结果各给药组大鼠的可能最大镇痛百分率较空白组均不同程度升高，其中战骨总黄酮提取物高剂量组和阳性对照组大鼠差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。总黄酮提取物各剂量组大鼠的可能镇痛百分率较阳性对照组差异均无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠的可能最大镇痛百分率测定结果见表4。

3.2.4 战骨总黄酮提取物对小鼠鼠尾压痛反应的影响结果与空白组比较[痛阈提高值为（18.89±4.40） g]，战骨总黄酮提取物高、中剂量组和阳性对照组小鼠的痛阈提高值[分别为（26.61±8.85）、（20.01±2.11）、（24.11±4.37） g]显著升高（P<0.05），战骨总黄酮提取物低剂量组小鼠的痛阈提高值[（19.47±3.96） g]差異无统计学意义（P>0.05）。战骨总黄酮提取物各剂量组小鼠的痛阈提高值与阳性对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。

4 讨论

战骨的临床用量约为15 g[1]，依据人体与动物给药剂量换算方法，计算得出大鼠战骨总黄酮提取物的给药剂量应为 0.275 g/kg、小鼠为0.391 g/kg[13]。通常情况下，经皮给药制剂需要加入一定量的透皮吸收促进剂以提高药物的透皮吸收，如果处方中不含有吸收促进剂，药物则很难透过皮肤的角质层进入皮下毛细血管。因此，考虑到无吸收促进剂时药物的透皮吸收效果，本课题组将该剂量设为中剂量。

大多数中药口服制剂均存在服用后溶出度低，吸收差，肝、肠首关效应以及生物利用度较低等问题，从而影响其治疗的效果。经皮给药制剂相对来说存在一定的剂型优势，故本课题通过经皮给药的方式，设计2种经典的抗炎实验（二甲苯致炎实验和弗氏完全佐剂致炎实验）以及3种经典的镇痛实验（乙酸致痛实验、热板致痛实验和光热甩尾实验）[12，14-15]对广西特色壮药战骨总黄酮提取物的抗炎、镇痛活性进行研究，探讨其经皮给药的可行性，以期能更好地发挥其临床疗效。经皮给药的药效与皮肤透药量有关。本研究结果显示，中、低剂量战骨总黄酮提取物在部分实验中未表现出显著活性，推测其在无吸收促进剂的情况下由于药物量较小，使得有效成分难以透过皮肤，最终造成药效不明显；相比之下，高剂量战骨总黄酮提取物的皮肤透过量明显增加，这可能是其表现显著抗炎、镇痛活性的原因，这也说明了必要时经皮给药制剂应使用吸收促进剂来提高药物的药效。

本研究结果表明，战骨总黄酮提取物经皮给药具有一定的抗炎、镇痛作用，且呈现出一定的剂量依赖性。因本研究是初步探讨战骨总黄酮提取物经皮给药的可行性，本课题组后期将对加入吸收促进剂后战骨提取物的透皮效果进行进一步研究，比如加入战骨提取的挥发油、氮酮、丙二醇、二甲基亚砜等，或常见的中药促渗剂冰片、薄荷脑等[11]。

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