皮文霞 赵文望 蔡宝昌 陆兔林 郁红礼

中图分类号 R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）19-2652-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.14

摘 要 目的：制备槐花对照提取物，并以其为对照测定槐花中4个黄酮类成分含量。方法：用水提法制备槐花对照提取物；采用高效液相色谱法测定其中芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素的含量；色谱柱为Diamonsil C18（2），流动相为甲醇-1%冰乙酸水溶液（梯度洗脱），检测波长为360 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。以槐花对照提取物为对照测定槐花中4个成分的含量，并与以化学对照品为对照的测定结果进行比较。结果：在所制槐花对照提取物中，4个成分的含量占86.85%；芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素的检测进样量线性范围分别为0.076 8～3.07、0.002 24～0.089 6、0.001 59～0.063 7、0.003 40～ 0.136 μg（r均≥0.999 5）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD≤2.30%（n=6），加样回收率分别为100.4%、96.99%、102.3%、100.9%（RSD分别为2.51%、1.58%、2.97%、3.20%，n=6）。两种方法中4个成分的含量测定结果比较差异无统计学意义（P>0.05）。 结论：以制备的槐花对照提取物为对照建立的测定方法操作简便、重现性好，并能同时测定槐花中4个成分的含量，可用于槐花饮片的质量控制。

关键词 槐花；对照提取物；制备；高效液相色谱法；黄酮类成分；含量测定

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare reference extract of Sophora japonica and used it as reference substance to determine the contents of 4 flavonoids in S. japonica. METHODS： The reference extract of S. japonica was prepared by water extraction. HPLC method was adopted to determine the contents of rutin， kaempferol-3-O-rutinoside， narcissoside and quercetin. The determination was performed on Diamonsil C18（2） column with mobile phase consisted of methanol-1% acetic acid （gradient elution）. The detection wavelength was set at 360 nm， the column temperature was 30 ℃， and sample size was 10 μL. The contents of 4 components in S. japonica were determined by using reference extract of S. japonica as reference， and compared with the results with chemical control as reference. RESULTS： In prepared reference extract of S. japonica， the contents of 4 components were 86.85%. The linear range was 0.076 8-3.07 μg for rutin， 0.002 24-0.089 6 μg for kaempferol 3-O-rutinoside， 0.001 59-0.063 7 μg for narcissoside and 0.003 40-0.136 μg for quercetin （all r≥0.999 5）. RSD of precision， stability and reproducibility tests were all ≤2.30% （n=6）. The recoveries were 100.4%， 96.99%， 102.3% and 100.9%（RSD were 2.51%， 1.58%， 2.97%， 3.20%， n=6）， respectively. There was no statistical significance in the content determination of 4 components between 2 kinds of methods （P>0.05）. CONCLUSIONS： Using prepared reference extract of S. japonica as reference， established method is simple and reproducible， and can be used for simultaneous determination of 4 components in S. japonica and quality control of S. japonica decoction piece.

KEYWORDS Sophora japonica； Reference extract； Preparation； HPLC； Flavonoids； Content determination

對照提取物是三大类中药标准物质（中药化学对照品、对照药材、对照提取物）之一，为非单体成分的对照物[1-3]。2015年版《中国药典》（四部）收载了21个对照提取物[4]。针对化学对照品研制困难、分离难度大、单体不稳定、检测成本高等问题，对照提取物以其制备成本低、可进行多组分检测等优势而具有较广阔的应用前景[5-7]。

槐花为豆科植物槐（Sophora japonica L.）的干燥花及花蕾。夏季花开放或花蕾形成时采收，及时干燥，除去枝、梗及杂质；开放者习称“槐花”，花蕾习称“槐米”；其性苦，微寒；归肝、大肠经，具有凉血止血、清肝泻火的功效。主治便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝热目赤、头痛眩晕等症[8]。槐花含黄酮类成分，主要包括芦丁 （含量达8%～20%）、槲皮素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷（又称水仙苷）及鞣质等，此外还含有皂苷类、甾体类等多种成分[9-11]。2015年版《中国药典》（一部）中仅将芦丁作为槐花的含量检测指标[8]，不能全面反映其质量。本课题组先制备了槐花对照提取物，并以此为对照，同时测定了槐花饮片中芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、槲皮素4个黄酮类成分的含量，同时与以化学对照品为对照的测定结果进行比较，为采用对照提取物法对槐花饮片进行多指标质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

e2695高效液相色谱（HPLC）仪、2998二极管阵列检测器、Empower 3色谱工作站（美国Waters公司）。

1.2 药材、对照品与试剂

槐花饮片（批号：140501、140601、140602、140603、140701、140702、140703）由安徽泰源中药饮片有限公司提供，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为豆科植物槐的干燥花及花蕾；芦丁（批号：MUST-14102301）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（批号：MUST-14110508）、水仙苷（批号：MUST-14021713）对照品均购于成都曼思特生物科技有限公司（纯度：均≥98%）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100081-200907，纯度：≥98%）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯（上海申博化工有限公司）。

2 方法与结果

2.1 槐花对照提取物的制备

取槐花饮片（批号：140501）5 g，打粉，过2号筛。分别以15、10、10倍样品质量的水煎煮提取60、30、30 min。第1次须待水沸腾后加入槐花，注意补充水分。用脱脂棉滤过，合并3次滤液，浓缩至50 mL，放冷待沉淀析出。过滤，用纯水润洗沉淀3次，抽干。再用50 mL热水溶解沉淀，趁热过滤，放冷析出沉淀，取沉淀并移至蒸发皿中，60 ℃蒸干，得对照提取物（0.075 g）。

2.2 槐花对照提取物中4个成分的定量分析

以芦丁、水仙苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素化学对照品为对照，测定提取物中4个黄酮类成分的含量。

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A为甲醇、 B为1%冰乙酸水溶液，梯度流脱（0～15 min，35%→45%A；15～25 min，45%→60%A；25～30 min，60%→35%A）；流速：0.8 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。在上述色谱条件下，取“2.2.2”“2.2.3”项下溶液进样分析，待测成分峰理论板数均不小于4 000，各峰间分离度均大于1.5。色谱图见图1。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、槲皮素对照品1.13、1.22、1.23 mg，各用甲醇定容于10 mL量瓶中；另称取芦丁对照品6.06 mg置于25 mL量瓶中。精密吸取已定容的山柰酚-3-O-芸香糖苷1.78 mL、水仙苷0.936 mL、槲皮素2.57 mL，用甲醇定容于含芦丁的25 mL量瓶中，制成混合对照品溶液，作为母液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取减压干燥至恒质量的槐花对照提取物约5 mg，精密称定，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.4 线性关系与定量限考察 精密量取混合对照品溶液5 mL，用甲醇定容至25 mL，再用甲醇分别稀释1、2、5、10、20、40倍，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。以峰面积为纵坐标（y）、对照品质量浓度为横坐标（x），绘制标准曲线并进行线性回归，得芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素的回归方程分别为y=19 504x+ 1 632（r=0.999 7）、y=18 386x-1 045.5（r=0.999 5）、y=22 119x-1 135（r=0.999 5）、y=47 456x-7 843.9（r=0.999 8），表明4种成分的进样量线性范围分别为0.060 5～2.42、0.002 01～0.080 5、0.001 14～0.045 7、0.003 15～0.126 μg。取“2.2.2”项下混合对照品溶液倍比稀释至一系列的低质量浓度后进样分析，记录4个成分的信噪比为10时所对应的质量浓度。结果，芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素的定量限依次为6.21、0.21、0.12、0.32 μg/mL。

2.2.5 精密度试验 取同一份混合对照品溶液，连续进样6次，测得芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素峰面积的RSD分别为0.68%、3.69%、2.05%、1.34%（n=6）。

2.2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样分析，测得芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素峰面积的RSD分别为0.88%、2.65%、3.08%、1.38%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 分别精密称取槐花对照提取物6份，按“2.2.3”项下方法制备成供试品溶液，进样分析。结果，芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素峰面积的RSD分别为0.38%、1.34%、3.13%、1.21%（n=6），表明该法重复性良好。

2.2.8 加样回收试验 采用空白加样回收方法进行试验。结果，芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素的平均回收率分别为99.90%、98.62%、102.30%、95.81%，RSD分别为3.22%、2.24%、1.97%、1.42%（n=6）。

2.2.9 槐花对照提取物的标定 取槐花对照提取物约5 mg，共3份，精密称定，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰面积，以外标法计算含量。结果，4个成分含量占槐花对照提取物质量的86.85%。槐花对照提取物中4个成分的含量测定结果见表1。

2.3 采用对照提取物-HPLC法测定槐花饮片中4个成分的含量

2.3.1 槐花对照提取物溶液的制备 精密称取已标定含量的槐花对照提取物9.75 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为对照提取物溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 分别称取6个不同批次的槐花饮片（批号：140601、140602、140603、140701、140702、140703）粗粉（过2号筛）约0.2 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称质量；超声（功率：250 W，频率：25 kHz）30 min，放冷；再称质量，甲醇补足质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液2 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3.3 线性关系与定量限考察 精密量取“2.3.1”项下的槐花对照提取物溶液5 mL，用甲醇定容于25 mL量瓶中；再分别量取“2.3.1”项下的槐花对照提取物溶液5、1、0.5、0.25 mL，各置于10 mL量瓶中，加甲醇摇匀，定容至刻度，配成系列质量浓度溶液，进样测定。以峰面积为纵坐标（y）、相应的对照提取物中4个成分的质量浓度为横坐标（x），绘制标准曲线并进行线性回归，得芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素的回归方程分别为y=21 166x-48 439（r=0.999 6）、y=23 871x-4 366.4（r=0.999 5）、y=23 258x-3 232.2（r=0.999 5）、y= 56 071x-11 209（r=0.999 8），表明芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素进样量线性范围分别为0.076 8～3.07、0.002 24～0.089 6、0.001 59～0.063 7、0.003 40～0.136 μg。取槐花對照提取物溶液，倍比稀释至一系列的低质量浓度，吸取10 μL注入色谱仪，记录4个成分的信噪比为10时所对应的质量浓度。结果，芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素的定量限依次为7.81、0.25、0.17、0.36 μg/mL。

2.3.4 精密度、稳定性、重复性和加样回收试验 按“2.2.5～2.2.8”项下相关方法进行试验。结果， 在精密度试验中，芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素峰面积的RSD分别为0.55%、1.61%、1.89%、0.68%（n=6）；在稳定性试验（24 h）中，4个成分峰面积值的RSD分别为0.43%、1.70%、2.30%、0.83%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定；在重复性试验中，4个成分峰面积的RSD分别为1.34%、2.12%、1.58%、1.56%（n=6）；在加样回收试验中，4个成分的平均回收率分别为100.40%、96.99%、102.30%、100.90%，RSD分别为2.51%、1.58%、2.97%、3.20%（n=6）。

2.3.5 样品含量测定 取6批槐花饮片（批号：140601、140602、140603、140701、140702、140703）粗粉，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。计算4个成分的含量，结果见表2，槐花饮片供试品（批号：140601）溶液色谱图见图2。

将以对照提取物法为对照测定的6批槐花饮片中的4个成分含量与以化学对照品为对照测定的结果，采用SPSS 17.0行配对t检验进行比较，结果，6批样品中，芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素对应的P分别为0.380、1.181、0.859、0.135，均>0.05，显示二者之间差异无统计学意义，表明可以对照提取物为对照对槐花饮片进行质量控制。

3 讨论

槐花的主要活性成分是黄酮类化合物，故本试验在对照提取物的制备中选取了化学性质比较稳定、便于提取分离且含量较高的4个黄酮类成分（芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷和槲皮素）作为指标成分。研究结果表明，以对照提取物为对照的测定结果与以化学对照品为对照所测定的含量结果差异无统计学意义。在槐花饮片的4个被测成分中，除芦丁和槲皮素外，另2个成分的化学对照品供应量较少且售价较高，而槐花对照提取物的制备和应用将解决此类单体对照品分离难度大、成本较高等问题，实现中药多指标成分的质量控制[12-14]。

本试验结果显示，以槐花对照提取物为对照建立的测定法的主要优点有：（1）对照提取物分离难度小，价格低廉，便于大量制备；（2）对照提取物含多个成分，类似于混合对照品，具备定性指纹图谱的特征，可简化研究内容，提高工作效率；（3）减少了相对昂贵的单一化学对照品的使用，节约了研究成本。此对照提取物若要实现商品化，研究工作还有待进一步完善，如进行长期稳定性试验和放大试验等。

在以多指标质量控制为趋势的中药研究的大环境下，对照提取物具有较大的发展应用潜力。以对照提取物为对照的方法虽然有诸多优点，但目前在国内的研究仍处于起步阶段，尚存在品种少、缺乏明确的规范与标准等问题，亟待进一步加大研究力度与设定相关规范标准，为中药的质量控制提供科学依据[15-16]。

参考文献

[ 1 ] 陆兔林，翟为民，蔡宝昌，等.对照提取物在中药质量控制中的应用[J].中国中药杂志，2013，38（3）：462-465.

[ 2 ] 朱星宇，赵根华，高倩倩，等.对照提取物法测定补骨脂饮片中7种成分含量[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（15）：85-91.

[ 3 ] 郭隆钢，巫少娟，孙帅，等.人参对照提取物的应用研究：人参皂苷成分的质量分析[J].中药新药与临床药理，2017，28（6）：771-776.

[ 4 ] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：四部[S]. 2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：343.

[ 5 ] 刘绍勇，张文明，潘建超，等.对照提取物用于金银花药材的质量控制方法研究[J].中国中药杂志，2013，38（13）：2147-2150.

[ 6 ] 陶益，张畅，李伟东，等.对照提取物法测定女贞子饮片中4种成分的含量[J].中国药房，2015，26（33）：4685-4687.

[ 7 ] 李铮，孟兰兰，傅欣彤，等.甘草对照提取物的制备及质量研究[J].药物分析杂志，2017，37（4）：664-669.

[ 8 ] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S]. 2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：363.

[ 9 ] HE X，BAI Y，ZHAO Z，et al. Local and traditional uses，phytochemistry，and pharmacology of Sophora japonica L.：A review[J]. J Ethnopharmacol，2016，187（5）：160- 182.

[10] ISHIDA H，UMINO T，TSUJI K，et al. Studies on antihemorrhagic substances in herbs classified as hemostatics in Chinese medicine.Ⅵ.On the antihemorrchagic principle in Sophora japonica L.[J]. Chem Pharm Bull（Tokyo），1987，35（2）：857-860.

[11] 李娆娆，原思通.中药槐花饮片RP-HPLC特征图谱研究[J].药物分析杂志，2010，30（11）：2137-3141.

[12] 金晶，赵新海. GC-MS法结合AMDIS及保留时间分析槐花提取物成分[J].安徽农业科学，2017，45（21）：85-88.

[13] 周陆怡，潘文嘉.槐花米中蘆丁提取的优化研究[J].海峡药学，2017，29（1）：34-36.

[14] 张伟云，王丽荣，许长江，等.槐花提取物降血糖活性研究[J].上海中医药杂志，2017，51（5）：93-97.

[15] 黄琴伟，赵维良，严爱娟，等.对照提取物在银杏叶制剂特征图谱中的应用[J].医药导报，2017，36（7）：794-797.

[16] 陈沛，金红宇，孙磊，等.对照提取物在中药整体质量控制中的应用[J]. 药物分析杂志，2016，36（2）：185-195.

（收稿日期：2018-05-02 修回日期：2018-07-02）

（编辑：刘 萍）