安飞飞 冷青云 李开绵 陈松笔

摘要：【目的】分析木薯华南8号（SC8）及其四倍体块根中淀粉代谢相关基因表达情况，为揭示多倍化影响木薯块根淀粉代谢的分子机制及木薯块根中淀粉的合成与分解途径提供理论参考。【方法】利用秋水仙素诱导木薯腋芽以获得SC8四倍体，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对蔗糖磷酸合酶（SPS）、ADP葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、可溶性淀粉合成酶（SSS）、颗粒结合合成酶（GBSS）、分支酶（SBE）、α-淀粉酶（α-amylase）、β-淀粉酶（β-amylase）和淀粉磷酸化酶（SP）等基因的表达情况进行分析。【结果】经秋水仙素诱导获得的SC8四倍体植株叶片较SC8二倍体厚，且叶色深绿。SC8四倍体块根的干物率和粗淀粉含量均较SC8二倍体显著降低（P<0.05，下同），而支链淀粉和直链淀粉比例均未发生显著变化（P>0.05，下同）。与SC8二倍体相比，MeSPS2、Meα-amylase和Meβ-amylase基因的表达量显著上调（P<0.05，下同），表明SC8四倍体块根中淀粉的分解能力较SC8二倍体强；MeAGPase、MeSSS1、MeSP1和MeSP2基因的表达量显著上调，表明SC8四倍体块根淀粉的合成能力较SC8二倍体弱；MeGBSSI和MeSBE1基因的表达量未发生显著变化，表明SC8四倍体块根中直链淀粉和支链淀粉的合成能力与SC8二倍体无明显差异。【结论】利用秋水仙素诱导获得的SC8四倍体块根淀粉合成能力降低和淀粉分解能力升高是导致其块根中粗淀粉含量显著降低的主要原因。

关键词： 木薯；四倍体；淀粉含量；淀粉代谢；基因表达；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

中图分类号： S533.035.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）08-1484-06

0 引言

【研究意义】木薯为大戟科木薯属植物，素有淀粉之王的美誉，是世界热带地区主要的粮食作物之一，其育种方式以杂交育种为主，但育种周期长，且很多性状无法得到有效改良。由于多倍体育种可缩短育种周期，加速育种进程（曹向宇等，2005；丛汉卿等，2016；梁海波等，2016；欧珍贵等，2017），故被广泛应用于木薯育种工作。木薯块根产量与其淀粉含量及代谢密切相关，淀粉代谢受多种蛋白酶调控，主要涉及蔗糖磷酸合酶（SPS）、ADP葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、可溶性淀粉合成酶（SSS）、颗粒结合合成酶（GBSS）、分支酶（SBE）、α-淀粉酶（α-amylase）、β-淀粉酶（β-amylase）和淀粉磷酸化酶（SP）。因此，研究华南8号（SC8）四倍体块根中淀粉代谢相关基因的表达模式对木薯多倍体育种具有重要指导意义，也可为研究SC8染色体加倍后淀粉含量下降的分子机制提供理论参考。【前人研究进展】目前，国内外已有大量关于木薯多倍体育种的研究报道。木薯染色体加倍后，叶片加厚加大，叶色深绿，块根明显增大，产量、淀粉含量均较二倍体高（陈显双等，2008；聂扬眉等，2013）；也有研究结果显示，木薯多倍体叶片光合速率提高（凡杰，2012；安飞飛等，2013；An et al.，2014；宋红艳等，2014），但块根干物率、淀粉含量和单株鲜薯重均显著下降（安飞飞等，2015）。木薯块根淀粉含量与淀粉代谢息息相关。有关木薯淀粉代谢研究主要集中在其机理方面，块根中淀粉的生物合成底物为蔗糖，其由SPS催化合成，经运输在块根中转化成1-磷酸葡萄糖（G1P），AGPase催化G1P和ATP转化为ADP葡萄糖，该反应是淀粉合成中最关键的环节，ADP葡萄糖作为淀粉合成的原料在GBSS催化下生成直链淀粉，而在SSS和SBE催化下合成支链淀粉（唐维等，2011；朱晔荣等，2013）。淀粉分解过程涉及SP、α-amylase和β-amylase（Geigenberger，2003；张海萍和阎长生，2003；Zanella et al.，2016），其中SP既催化淀粉分解又参与淀粉合成，具体反应方向由底物相对浓度决定（Mu et al.，2001）。α-amylase为内切酶，可直接切下一分子葡萄糖，而β-amylase为外切酶，可切下麦芽糖（李志远等，2017）。许娟等（2012）、覃琼瑶等（2016）对MeAGPase、MeGBSS和MeSBE基因在木薯不同发育期的表达量进行分析，结果发现这3个基因与块根干物质率呈显著正相关，且表达模式具有时间和组织特异性。王淑娟等（2015）研究发现，以外源脱落酸（ABA）处理木薯叶片可明显抑制淀粉合成的上游基因表达。【本研究切入点】目前，鲜见有关木薯多倍体与二倍体块根中淀粉代谢相关基因表达水平差异的研究报道。【拟解决的关键问题】以SC8及其诱导获得的四倍体为试验材料，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测参与淀粉代谢的8个蛋白酶基因的表达情况，以期揭示多倍化影响木薯块根淀粉代谢的分子机制，也为研究木薯块根中淀粉的合成与分解途径提供理论参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为SC8，来自于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家木薯种质资源圃。SYBR? Premix Ex Taq? II购自TaKaRa公司，植物总RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，cDNA第一链试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。主要仪器设备：流式细胞仪（CyFlow Ploidy Anlyser Sysmex，日本）、Thermo Scientific Pi-koREAL Thermocycler（Thermo Scientific，美国）和自动数显旋光仪（上海浦东物理光学仪器厂）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 SC8四倍体制备 取生长状态一致的SC8组培苗，在无菌条件下切成带腋芽的茎段，置于灭菌的10 mg/L秋水仙素溶液中浸泡72 h后接入MS培养基（附加0.02 mol/L萘乙酸、3%蔗糖和8%蔗糖）。以双蒸水为对照处理。

1. 2. 2 DNA倍性鉴定 采用流式细胞技术鉴定木薯嫩叶单细胞DNA倍性：取0.2 g木薯嫩叶置于含1 mL缓冲液（WPB）[0.2 mol/L Tris-HCl，86 mmol/L NaCl，10 mmol/L焦亚硫酸钠，4 mmol/L MgCl2·6H2O，2 mmol/L EDTANa2·2H2O，1% PVP-10，1%（v）Triton X-100，pH 7.5]（Loureiro et al.，2007）的培养皿中用刀片剁碎，2 min后用300目尼龙网过滤，滤液加入50 ?L 10 mg/mL DAPI，5 min后置于流式细胞仪上检测，设置二倍体对照植株在200通道，检测样品DNA含量，以确定其DNA倍性。将鉴定为四倍体植株切成茎段进行多代无性繁殖，并再次检测其倍性。

1. 2. 3 总RNA提取 将研钵、研磨棒和勺子用300 ℃烘箱烘4 h，用液氮将木薯块根研磨至粉碎，称取0.1 g粉末，参照植物总RNA提取试剂盒说明提取总RNA，利用反转录试剂盒反转录合成cDNA第一链。

1. 2. 4 引物设计 从Phytozome基因组数据库（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）搜索木薯淀粉代谢途径中的关键酶基因序列，包括MeSPS2、MeAGPase、MeSSS1、MeGBSSI、MeSBE1、Meα-amylase、Meβ-amylase、MeSP1和MeSP2，并利用Primer 5.0设计其qRT-PCR引物（表1），委托英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1. 2. 5 qRT-PCR检测 将合成的cDNA稀释5倍为模板，qRT-PCR检测淀粉代谢途径中关键酶基因的表达情况，以actin基因为内参。反应体系10.0 μL：SYBR Premix Ex Taq? II 5.0 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，milliQ H2O补足至10.0 μL。将反应体系置于定量PCR仪中进行扩增，扩增程序：95 ℃预变性7 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共进行40个循环；20 ℃ 10 min。采用2-ΔΔCt 计算各基因的相对表达量。

1. 2. 6 木薯块根干物率、粗淀粉含量、支链淀粉和直链淀粉比例测定 采用烘干法测定块根干物率：取适量的鲜薯样品置于60 ℃干燥箱内烘干至恒重，根据公式计算块根干物率（%）=薯干重/鲜薯重×100。将烘干的木薯块根磨成粉末，采用氯化钙—旋光法（GB/T 5514—2008）测定干粉中的淀粉含量，再根据干物率折合计算鲜薯粗淀粉含量（%），精确至0.1%。用比色法测定块根淀粉在620 nm处的光密度，通过标准曲线确定样品中直链淀粉和支链淀粉比例（古碧等，2009）。

1. 3 统计分析

采用Excel 2007和DPS v7.55对试验数据进行统计分析，并以新复极差法（Duncans）进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2. 1 SC8四倍体制备及DNA倍性鉴定结果

从图1可看出，經无性繁殖后获得稳定的SC8四倍体组培苗（图1-B）和大田苗（图1-D），其叶片较SC8二倍体组培苗（图1-A）和大田苗（图1-C）厚，且叶色深绿。

2. 2 DNA倍性鉴定结果

采用流式细胞技术鉴定木薯嫩叶单细胞DNA倍性，结果如图2所示。SC8二倍体植株叶片的峰值在荧光强度为200通道的位置（图2-A），而SC8四倍体叶片的峰值在荧光强度为400通道的位置（图2-B），说明诱导得到的变异株叶片单细胞DNA含量是二倍体的2倍，即为SC8四倍体。

2. 3 块根干物率、粗淀粉含量及组成分析结果

将鉴定为SC8四倍体的幼苗种植10个月后，测定其块根干物率、粗淀粉含量及支链淀粉和直链淀粉比例，结果如表2所示。SC8四倍体块根干物率和粗淀粉含量分别为30.42%和30.60%，较SC8二倍体极显著降低15.59%和12.07%（P<0.01）。SC8四倍体块根中直链淀粉和支链淀粉分别占总淀粉含量的比例为9.36%和90.64%，与SC8二倍体无显著差异（P>0.05，下同）。可见，SC8染色体加倍后虽然木薯块根的干物率和粗淀粉含量降低，但未改变其淀粉组分。

2. 4 淀粉代谢相关基因表达谱分析结果

将MeSPS2、MeAGPase、MeSSS1、MeGBSSI、Me-SBE1、Meα-amylase、Meβ-amylase、MeSP1和MeSP2基因在SC8二倍体块根中的表达量设为1.0，在SC8四倍体块根中的表达量如图3所示。MeSPS2、Meα-amylase和Meβ-amylase基因的表达量均显著上调（P<0.05，下同），分别是SC8二倍体块根表达量的1.55、1.84和1.30倍，由于SPS、α-amylase和β-amylase参与淀粉的分解代谢，表明SC8四倍体块根中淀粉的分解能力较SC8二倍体强。MeAGPase、MeSSS1、MeSP1和MeSP2基因的相对表达量均显著下调，分别是SC8二倍体块根表达量的36%、62%、48%和24%倍，由于AGPase、SSS和SP参与淀粉的合成代谢，表明SC8四倍体块根淀粉的合成能力较SC8二倍体弱。MeGBSSI和MeSBE1基因的表达量未发生显著变化，由于GBSSI和SBE参与支链淀粉和直链淀粉的合成，表明SC8四倍体块根中直链淀粉和支链淀粉的合成能力与SC8二倍体无明显差异。

3 讨论

本研究诱导获得的木薯SC8四倍体未发生退化现象，与前人研究结果（安飞飞等，2013）一致，而SC8二倍体和四倍体块根的干物率、淀粉含量和直链淀粉比例与前人研究结果（安飞飞等，2015）存在一定差异，但趋势一致，推测其原因是这些块根指标受收获月份、降雨量等因素影响。古碧等（2014）、谢彩锋等（2014）、徐海强等（2017）的研究结果也表明木薯块根的干物率、淀粉含量、氢氰酸等指标与品种、种植区域、生长季节、天气等因素有关。

目前，有关木薯四倍体与二倍体块根淀粉代谢差异的研究鲜见报道。安飞飞等（2015）研究发现，SC8四倍体块根中参与淀粉代谢的SPS、β-amylase和GBSSI的表达水平与淀粉含量、支链淀粉和直链淀粉比例呈正相关。朱艳梅等（2016）、程艳娥等（2017）研究表明，木薯块根AGPase活性和叶片SPS活性与块根淀粉含量呈正相关，而块根中SPS、α-amylase和β-amylase等淀粉分解酶活性与淀粉含量呈负相关。本研究采用qRT-PCR检测参与淀粉代谢的8个蛋白酶基因的表达情况，结果发现各基因的表达量存在明显差异，如SC8四倍体中MeSPS2基因的表达量显著上调，是SC8二倍体的1.55倍，由于SPS参与淀粉的分解代谢，也是蔗糖合成的关键酶之一（崔光军等，2010），故推测SC8四倍体块根中淀粉的分解能力较SC8二倍体强，利用蔗糖的能力也较强，但从测定的淀粉含量可知，MeSPS2基因高表达并未提高四倍体块根利用蔗糖的能力；SC8四倍体块根中MeAGPase基因的表达量显著下调，在一定程度上限制了淀粉积累的速率，与包劲松（1999）的研究结果相似，即AGPase通过基因表达限制淀粉积累速率一致；SC8四倍体块根中MeGBSSI和MeSBEI基因的表达量与SC8二倍体无显著差异，由于GBSSI和SBE是控制直链淀粉和支链淀粉合成的关键酶，其中GBSSI主要在块根表达，参与直链淀粉的合成（林立铭，2014），SBE决定支链淀粉分支结构（袁亮等，2006），但不影响支链淀粉的比例（武维华，2005），该结果进一步验证安飞飞等（2015）的研究结论；SC8四倍体中Meα-amylase和Meβ-amylase基因表达量均较 SC8二倍体显著上调，由于α-amylase和β-amylase是参与淀粉分解代谢的关键酶，说明木薯DNA加倍后参与淀粉分解过程的基因表达较活跃；SC8四倍体中MeSP2基因的表达量较SC8二倍体显著下调，且其粗淀粉含量也较SC8二倍体显著降低，由于SP可能与淀粉的合成相关（Chen et al.，2002；Satoh et al.，2008），也可能与淀粉的分解相关（Carvalho et al.，2004），故推测SP参与块根淀粉合成过程，其原因是块根中MeSP基因的表达水平下降后，块根中也出现淀粉含量显著降低的现象。综上所述，SC8四倍体块根中参与淀粉合成代谢的相关基因表达量远低于SC8二倍体，而参与淀粉分解代谢的相关基因表达量高于SC8二倍体，导致块根淀粉合成能力降低和淀粉分解能力升高，从而使块根粗淀粉含量下降。

4 结论

利用秋水仙素诱导获得的SC8四倍体块根淀粉合成能力降低和淀粉分解能力升高是造成其块根中粗淀粉含量显著下降的主要原因。

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（責任编辑 陈 燕）