李士侠（枣庄科技职业学院职教中心，山东滕州 277599）

高脂血症（hyperlipdemia，HLP）是一种或几种脂类代谢失调诱导的血液中脂质代谢紊乱的疾病[1]。随着生活质量的提高，中老年人高蛋白、高脂饮食日益增多，加上运动量减少，血中脂肪无法代谢而积累，最后发展为高血脂。大量研究证实[2,3]，高血脂是诱发冠心病、动脉粥样硬化和心肌梗死等疾病的主要危险 因素。流行病学数学显示[4]，血液中总胆固醇和低密度脂蛋白浓越高，罹患心脑血管疾病的危险性就越高。因此，积极治疗并预防HLP对减少心脑血管疾病的发生有重要意义。高脂血症药物治疗研究表明[5]，有效的降脂治疗可显著改善冠心病患者的病情，提高生活质量。然而，当下HLP治疗药物如他汀类、贝特类等调脂药，不良反应限制了临床应用。因此开发寻找新的、安全的、有效的降脂药十分必要。

丹参作为中药常与他汀类降脂药联合应用治疗心血管疾病，其活性成分包括脂溶性的丹参酮和水溶性的丹参素。丹参素（salvianic acid，SA）是一种芳香酸类化合物，化学名D-(+)-β-(3,4二羟基苯基)乳酸[6]，具有抑制心肌肥大[7]、抗动脉粥样硬化[8]、抗肝纤维化[9]及抗癌[10]等多种药理活性。但是丹参素是否具有降脂作用，对抗血脂紊乱导致的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）上调，具体作用机制如何尚未有明确的报道。血清中胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及载脂蛋白等是反应机体脂质代谢的常见指标。上述代谢指标异常导致血脂代谢紊乱继而发生高血脂症，血液粘稠度增加，形成脂肪栓等附着于血管壁，极易诱发冠心病、心肌梗死等心脑血管疾病。从中药材中寻找有效单体成分治疗高血脂症，预防心脑血管疾病的发生成为近年来的研究热点。

因此，本文将构建高血脂大鼠模型，给予丹参素干预治疗，探究丹参素这一单体物质能否改善高血脂症，是否通过上调卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶（LCAT）和胆固醇 7α-羟化酶蛋白（CYP7A1）发挥降脂作用，现具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性SD大鼠，体重220±10 g，购自武汉大学动物实验中心，合格证[SCXK(鄂)2008-0004]。室内温度控制在24±2 ℃，大鼠自由饮食饮水适应性喂养1周。

1.2 仪器

全自动生化仪，PRONTO EVOLUTION，意大利；UV-1601紫外风光光度计，日本岛津；飞鸽牌离心机，FA1004分析天平；罗氏480荧光定量PCR仪，美国Roche公司；免疫印迹电泳系统，Bio-Rad。

1.3 药物与试剂

丹参素（sigma，其纯度＞98.0%），总胆固醇试剂盒（TC）、甘油三酯试剂盒（TG）低密度脂蛋白胆固醇试剂盒（LDL-C）高密度脂蛋白胆固醇试剂盒（HDL-C）、载脂蛋白 AI试剂盒（apoAI）和载脂蛋白B试剂盒（apoB）均购于南京建成生物工程研究所；卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶（LCAT）、胆固醇 7α-羟化酶蛋白（CYP7A1）和β-actin抗体均购自Abcam公司；BCA试剂盒购于碧云天生物技术研究所；LCAT和CYP7A1引物由美国Invitrogen公司合成；TRIzol总RNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；cDNA Kit合成试剂盒自罗氏公司。

1.4 方法

1.4.1 分组及给药

40只SD大鼠随机分为正常对照组（S）、高血脂症模型组（M）、丹参素高剂量组（20 mg/kg，SAH）和丹参素低剂量组（10 mg/kg，SAL），每组10只。正常组大鼠给予普通饲料喂养，其他组根据文献给予高脂饲料喂养8周，建立大鼠高脂血症模型[11,12]，边造模边灌胃给药。每日灌胃给药1次（1.0 mL/100 g），连续给药8周，正常对照组和模型组给予等量的生理盐水。8周后，每组大鼠腹主动脉取血，同时采集肝脏标本，进行各项指标的检测。

1.4.2 血脂测定

根据试剂盒说明书测定各组大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、apoAI和apoB含量。

1.4.3 实时定量PCR检测

称取 50 mg大鼠肝脏，利用 TRIzol法提取总RNA，然后将1 μg总RNA通过cDNA Kit试剂盒进行反转录。荧光定量PCR在LightCycler@480(Roche公司)设备中进行，每个样品设置 3个重复，并以GAPDH作为内参测定。定量PCR特异产物通过溶解曲线分析，以2-ΔΔCT表示相对基因表达变化。用于定量PCR的引物序列如下。

表1 实时定量PCR引物序列Table 1 The primer sequences of real-time PCR

1.4.4 免疫印迹Western-blot检测

蛋白裂解液提取肝脏组织蛋白样品，BCA法检测样品蛋白含量并调节蛋白浓度至相同，加入5×上样缓冲液沸水浴10 min，-80 ℃保存备用。取样20 μL蛋白样品上样，SDS-PAGE凝胶电泳，湿法转膜，脱脂奶粉封闭。分别如LCAT、CYP7A1和β-actin抗体4 ℃孵育过夜，次日加入二抗室温孵育后 ECL法曝光显色。

1.4.5 肝脏组织病理学形态检测

采集各组大鼠肝脏组织 4%多聚甲醛固定后，行石蜡包埋切片，HE染色，观察肝脏病理学变化。

1.5 统计分析

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行处理，先进行数据的正态分布检验，方差齐性检验，计量数据用±s表示，组间差异用单因素方差分析，p＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 丹参素对高血脂模型大鼠血脂水平的影响

有研究显示[13]，高脂血症的形成与血液中 TC、TG、LDL-C正相关，与HDL-C负相关；当血脂发生异常时，TC水平升高会沉积于血管壁上，TG含量增加可能激活凝血机制，促进血栓的形成，进而诱导动脉粥样硬化或是冠心病的发生。同时，LDL-C参与将肝脏中的TC转运至肝外组织，而HDL-C则是将肝外的TC转运到肝脏分解，代谢为胆汁酸。

本研究实验结果如表2所示，8周后模型组大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量分别升高至13.63±2.47 mmol/L、3.56±0.59 mmol/L 及 10.12±1.76 mmol/L，同时HDL-C水平下降至0.21±0.09 mmol/L，和正常组比较差异有统计学意义（p＜0.01），说明高血脂造模成功。给予丹参素灌胃治疗后，高剂量 SAH组大鼠血清中TC、TG和LDL-C的含量分别为6.56±3.49 mmol/L、1.77±33.15 mmol/L 及 5.31±1.07 mmol/L，低剂量 SAL组上述指标则分别降低至 9.34±4.07 mmol/L、2.25±28.69 mmol/L 及 6.63±1.46 mmol/L；与此同时，SAH 组和 SAL组 HDL-C含量升高至 0.69±0.11 mmol/L和0.52±0.13 mmol/L，和模型组比较有统计学差异（p＜0.01或p＜0.05）。这一结果表明，丹参素能显著逆转高脂血症大鼠血清TC、TG、LDL-C水平的上升和 HDL-C含量的下降；其中高剂量组降脂效果优于低剂量组，进一步说明丹参素具有促进 HDL-C上调加快肝外组织TC、TG的转运及降解的作用，且存在一定的量效关系。

在脂质转运及代谢过程中，载脂蛋白是一类具有特殊作用的脂蛋白，其维持了脂蛋白的结构并参与了运输，具有代表性的就是apoAI和apoB，不仅调空了有关代谢酶的活性，还是细胞表面脂蛋白受体的相关配体参与了脂蛋白代谢调节过程[14]。apoAI是高密度脂蛋白（HDL）的载体蛋白，具有清除肝外组织中游离胆固醇的作用。HDL-C将肝外游离TC转运至肝脏进行分解，卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶（LCAT）是这一代谢过程的关键酶。

apoAI水平的升高可激活LCAT活性，进一步促进TC的清除代谢。早期有报道，apoAI的上调能抑制动脉粥样硬化的形成[14]。apoB是LDL的载脂蛋白，可刺激血管平滑肌的增生，加速细胞内胆固醇的酯化过程，促使LDL-C沉淀。本研究结果证实，M组大鼠血清中 apoB水平上升至正常组的近 2倍，为0.59±0.01 g/L，apoAI水平则明显下降至 0.19±0.01 g/L（p＜0.01），高血脂症大鼠脂质代谢紊乱，载脂蛋白apoAI下调，apoB上调使得HDL和LDL转运失衡，TC、TG清除减慢，加剧了酯化过程。丹参素干预后，SAH组和SAL组大鼠血清中apoAI增加至0.24±0.01 g/L 和 0.22±0.00 g/L，apoB 下降至 0.41±0.01 g/L 和0.48±0.02 g/L，与 M 组比较差异有统计学意义（p＜0.01或p＜0.05）。丹参素可以调节载脂蛋白 apoAI上调及apoB下调，加快HDL-C对肝外游离TC的转运，逆转LDL-C的沉积，促使血脂代谢趋向于正常。

表2 丹参素对大鼠血脂TC、TG、LDL-C、HDL-C、apoAI及apoB含量的影响Table 2 The influence of Salvianic acid on the contents of TC, TG, LDL-C, HDL-C, apoAI and apoB in rats with the hyperlipidemia

2.2 丹参素对高血脂模型大鼠肝脏脂质关键代谢酶的调控作用

LCAT作为游离TC转运至肝脏分解代谢的关键酶，在调节机体胆固醇平衡具有重要作用[15]。胆固醇7α-羟化酶蛋白CYP7A1是胆汁酸合成的经典限速酶，游离的TC被转运到肝脏后需要在限速酶CYP7A1的作用下分解为胆汁酸才能排除体外[16]。血脂代谢紊乱发生高血脂症后，肝组织LCAT和CYP7A1水平会下调，如图1所示，模型组大鼠建模后肝脏组织中LCAT和CYP7A1mRNA表达量显著降低至正常组的1/2到1/3（p＜0.01），这与其他报道结果一致。丹参素干预后，SAH组和 SAL组大鼠肝组织 LCAT、CYP7A1mRNA表达水平与模型组比较明显增加，增加至模型组的近2倍（p＜0.05或p＜0.01）。高剂量组LCAT、CYP7A1mRNA表达水平回升接近正常对照组，表明丹参素逆转肝脏脂质代谢的关键酶基因的下调。

图1 丹参素对高血脂大鼠肝脏LCAT和CYP7A1基因mRNA的调控作用Fig.1 The regulation effect of Salvianic acid on the mRNA expressions of LCAT and CYP7A1 in rats with the hyperlipidemia

图2 丹参素对高血脂大鼠肝脏LCAT和CYP7A1蛋白的调控作用Fig.2 The regulation effect of Salvianic acid on the protein expressions of LCAT and CYP7A1 in rats with the hyperlipidemia

此外，本研究还采用免疫印迹评估了各组大鼠肝组织中LCAT和CYP7A1蛋白的表达。由图2可知，模型组大鼠肝脏组织中LCAT和CYP7A1表达量较正常组减少近60%（p＜0.01），这一结果和血清中各血脂指标变化相符合。给予丹参素治疗后，SAH组和SAL组大鼠肝组织LCAT、CYP7A1表达量与模型组比较明显增加（p＜0.05或p＜0.01）；尤其是高剂量组LCAT、CYP7A1蛋白表达量是模型组的2倍，接近正常组水平，效果优于低剂量组。丹参素可以通过上调高血脂大鼠肝组织LACT和CYP7A1的表达，促进HDL-C对肝外游离TC转运作用，加快TC分解胆汁酸排除，发挥逆转血脂升高作用，降至效果呈现剂量依赖性。

2.3 丹参素对高脂血症大鼠肝组织保护作用

肝脏是脂蛋白代谢的重要场所，当血脂含量升高，胆固醇和甘油三酯堆积易诱导肝细胞肿胀、破裂、坏死。图3可知，正常组大鼠肝组织HE染色显示肝细胞结构较为完整一致，未见脂肪病变（图 3a）。模型组大鼠肝组织HE可见肝细胞破裂，形态不完整，排列紊乱，细胞间隙出现大量空泡，发生脂肪病变，且有炎性细胞亲润（图 3b）。高血脂模型组大鼠肝细胞可见明显的脂肪病变，肝细胞胞浆疏松化，呈现严重的气球样变，这与Liu等[17]人的研究结果一致。给予丹参素干预后，SAH组（图3c）及SAL组（图3d）肝细胞有轻度脂肪变形，与模型组比较病变明显减轻，正常完整的肝细胞数目增多，高剂量组大鼠肝组织病 理改善结果优于低剂量组，丹参素具有逆转肝细胞肿胀、脂肪病变的作用。

3 结论

综上所述，丹参素具有降低高脂血症模型大鼠血脂水平的作用，其作用机制可能增加肝组织LCAT和CYP7A1基因和蛋白的水平，上调载脂蛋白apoAI及下调apoB，促进HDL-C的转运作用，清除TC、TG和LDL-C，更具体作用信号通路机制待进一步探究。