朱 璐，范小兵，王正皓，代 科，文心田，曹三杰，赵 勤，文翼平

（四川农业大学动物医学院/猪病研究中心，成都 611130）

副猪嗜血杆菌病又称格拉泽氏病，是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）引起的以猪浆膜炎、关节炎和脑膜炎等为特征的疾病[1]。副猪嗜血杆菌病一般发生于断奶后和保育阶段，感染后的发病率为10%～15%，发病猪的死亡率可达50%[2]。近些年，随着我国养猪业的发展，该病临床发病率和死亡率呈逐渐上升趋势，给养殖户带来巨大的经济损失[3-4]。P.Kielstein等[5]通过SPF猪感染实验证实HPS有 15个以上的血清型，其中血清型 1，5，10，12，13，14为强毒株。不同地区之间流行的血清型不同，其对猪造成的致病性也不同[6]。目前，接种疫苗是控制这一疾病的有效方法之一[7]，由于不同血清型菌株间交叉保护力不足，导致市售商品苗不能切实有效保护当地流行菌株的感染[8]。蔡旭旺等[9]和Zhang J.等[10]研究表明，当前我国HPS流行的优势血清型主要为4、5、12、13型等。本实验室近两年在四川地区成功分离HPS菌株100余株，血清型鉴定结果表明，其中5型和13型分离株最多[11]，且5型和13型均为强毒血清型[5]。S.Oliveira等[12]研究表明，HPS的免疫原性随菌株不同而不同，且认为毒力较高的HPS菌株其免疫保护力也较高。因此本实验选择了血清5型和血清13型HPS强毒株作为对象，进行了二价灭活苗的初步研制和免疫效果评价，为副猪嗜血杆菌病疫苗的研发和该病的防控奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株和实验动物

血清5型MC-203株和血清13型XJ-103株由四川农业大学猪病研究中心分离鉴定并保存。14日龄哺乳仔猪和35日龄断奶仔猪购自四川省阿坝州茂县生猪养殖有限公司，并经ELISA试剂盒检测HPS抗体呈阴性，严格隔离饲养。

1.2 材料

Tryptic Soy Agar（TSA）和Tryptic Soy Broth（TSB）（Oxoid）、NAD（Roche）、犊牛血清（Gibico）、铝胶佐剂（中牧生物科技有限公司）、ELISA试剂盒（美国爱德士生物科技公司）、HPS国产商品疫苗、HPS进口商品疫苗、TSA，TSB配置后添加5%犊牛血清和10 μg/mL的NAD、实验所涉及的其他各种试剂、药品均为分析纯。

1.3 二价灭活苗的制备

MC-203株和XJ-103株于TSB培养基中复苏，划线接种于TSA中连续传代，挑单菌落接种于TSB中，37℃培养12 h，收集菌液。各取少量收集的菌液，分别加入总体积为0.2%的甲醛，置于37℃灭活，每隔 2～4 h 摇匀一次。分别在第 14、16、18、20、22、24 h取少量的灭活菌液接种于TSA上置于37℃培养24 h，观察有无细菌生长。用PBS将灭活后的菌液重悬为1.0×1010个/mL，将MC-203株的菌液和XJ-103株的菌液等体积混合，再向混合菌液中加入等体积的佐剂（铝胶）混合均匀，分装至无菌瓶加盖密封，置4℃冰箱保存。按常规标准对研制的二价苗进行无菌检验[13]。

1.4 二价灭活苗的安全性检验

选取14日龄的哺乳仔猪和35日龄的断奶仔猪各10头，随机分为两组，I组疫苗组（14日龄和35日龄各5头）颈部肌肉注射2 mL灭活苗，II组对照组（14日龄和35日龄各5头）颈部肌肉注射2 mL无菌PBS。观察接种后猪的精神状态、接种部位局部变化、呼吸、体温和食欲等临床指标[14]。

1.5 灭活苗免疫仔猪的抗体水平测定

选5头HPS抗体阴性的14日龄仔猪，每头猪颈部肌肉注射2 mL灭活苗，3周后二免；分别在首免后第 7、14、28、56、84、112、140、168、196 天采血，用ELISA试剂盒检测仔猪HPS抗体水平[15]。

1.6 小白鼠半数致死量测定

MC-203株和XJ-103株于TSB培养基中复苏，划线接种于TSA中连续传代，挑单菌落接种于TSB中，37 ℃培养 12 h，收集菌液。参照寇氏法（Korbor），首先对这两株菌株进行预实验，根据预实验结果设置5个剂量组，每个剂量组的菌液7 000 g/min离心10 min，用0.5 mL PBS重悬备用。选择17～19 g健康昆明小白鼠72只，雌雄各半，平均分为12组，每个菌株设置5个实验组，1个对照组，实验组每只小白鼠经腹腔注射0.5 mL菌液，对照组每只小白鼠经腹腔注射0.5 mL PBS。观察并记录各剂量组小白鼠的死亡数和死亡率，连续观察7 d，计算各菌株的LD50。

1.7 仔猪毒力实验

MC-203株和XJ-103株于TSB培养基中复苏，划线接种于TSA中连续传代，挑单菌落接种于TSB中，37℃培养12 h，收集菌液。取培养好的菌液按各菌株的5×LD50的剂量[2]腹腔注射5头35日龄断奶仔猪（菌液离心后，用3 mL PBS重悬）。同时每个菌株设立5只仔猪腹腔注射无菌PBS作为对照（3 mL/头）[16]。观察和记录仔猪发病及死亡情况至10 d，死亡者立即解剖，取其内脏进行细菌的分离鉴定。

1.8 灭活苗免疫仔猪的保护效力

将40头35日断奶龄仔猪随机分为4组，每组10头。Ⅰ组免疫本实验制备的HPS二价灭活苗、Ⅱ组免疫进口商品苗，Ⅲ组免疫国产商品苗，Ⅳ组为PBS对照组。颈部肌肉注射，首免后间隔3周进行二免[17-20]。二免2周后，分别用MC-203株和XJ-103株以5×LD50的剂量对每头仔猪经腹腔攻毒3 mL菌液[16]；观察猪的临床情况，持续14 d。

2 结果与分析

2.1 二价苗无菌性检验

二价灭活苗的制备当菌液灭活到18 h时，菌液中还有少量的活菌；当灭活到20 h时，细菌被完全灭活。因此，制备该二价灭活苗的最优灭活时间是20 h。经过检验，制备的疫苗在TSA培养基上无任何微生物生长。

2.2 灭活苗的安全性检验

该HPS二价灭活苗免疫仔猪后的临床表现均正常。结果如表1所示。

表1 制备的HPS二价灭活苗对14日龄和35日龄仔猪接种的安全性检验（n=5）Table1 The safety test of the candidate bivalent inactivated vaccine on 14-day and 35-day piglets（n=5）

2.3 灭活苗免疫仔猪后抗体水平

首免14 d后，免疫组实验猪血清中可检测到特异性HPS抗体，免疫后抗体水平逐渐升高，并在第84 d达到峰值；之后抗体水平逐渐下降，在免疫后196 d仍然可以检测到HPS抗体。结果如表2所示。

表2 灭活苗免疫仔猪后不同时间特异性HPS抗体的OD450 nm及抗体水平结果Table2 The specific antibody against HPS of piglets at different time(d)and antibody level after inactivation vaccine inoculated

2.4 小鼠半数致死量测定

根据各组小白鼠的感染数和死亡数计算各剂量组的剂量对数和动物死亡百分率，LD50的计算公式 logLD50=∑1/2×（Xi+Xi+1）（Pi+1-Pi），其中 Xi与 Xi+1及Pi与Pi+1分别为相邻两组的剂量对数及动物死亡百分率。得出血清5型HPS分离株MC-203株的LD50为1.36×109CFU；血清13型HPS分离株XJ-103株的LD50为1.62×109CFU。结果如表3所示。

表3 MC-203株和XJ-103株的半数致死量测定结果Table3 Determination of 50%lethal dose of MC-203 and XJ-103 strains

2.5 仔猪毒力实验

6.8×109CFU的MC-203株的菌液和8.1×109CFU的XJ-103株的菌液接种的所有仔猪在70 h内全部死亡，剖检可见副猪嗜血杆菌病的典型病变（表4）。

表4 MC-203株和XJ-103株的仔猪攻毒实验Table4 Piglets challenging experiment with MC-203 and XJ-103

2.6 灭活疫苗免疫仔猪的保护效力

3种疫苗免疫仔猪后，用6.8×109CFU的MC-203株的菌液攻毒，自制二价灭活疫苗的保护率为80%，进口商品疫苗的保护率为80%，国产商品疫苗的保护率为60%（表5）。

表5 3种HPS疫苗二免35日龄仔猪2周后MC-203株菌液攻毒结果Table5 Protective rate of the 35-day pigs challenged with strain MC-203 of 2 weeks booster immunized with 3 kinds of HPS vaccines

3种灭活苗免疫仔猪后，用8.1×109CFU的XJ-103株的菌液攻毒，自制二价灭活苗的保护率为80%，进口商品疫苗的保护率为80%，国产商品疫苗的保护率为60%（表6）。

表6 3种HPS疫苗二免35日龄仔猪2周后XJ-103株菌液攻毒结果Table6 Protective rate of the 35-day pigs challenged with strain XJ-103 of 2 weeks booster immunized with 3 kinds of HPS vaccines

综合表4和表5可知，用血清5型MC-203株和血清13型XJ-103株攻毒后，自制二价灭活苗的总保护率为80%，进口商品疫苗的总保护率为80%，国产商品疫苗的总保护率为60%。

3 讨论与结论

副猪嗜血杆菌病是当今危害养猪业较严重的一种细菌性传染病，尤其是当HPS与其他病原混合感染时危害更加严重，给养猪业造成巨大的经济损失。目前主要是通过抗生素治疗本病，但随着菌株耐药性的问题日趋严重，致使治疗效果大打折扣，因此依靠疫苗防控是行之有效的方法。HPS血清型4型和5型灭活疫苗是我国施用的主要商品苗，其可以降低针对相应血清型病原造成的副猪嗜血杆菌病的死亡率和临床症状[21]，但由于HPS具有很强的地方性特征，O.P.Miniats等[8]研究结果表明，不同血清型的菌株间缺乏交叉保护，若商品疫苗菌株和致病菌株的血清型不同，会导致免疫失败；两株高毒力菌株所制备的疫苗诱发了可以同时抵抗同源和异源攻毒的交叉保护；两株低毒力菌株所制备的菌苗只能抵抗同源攻毒。因此本试验研制的疫苗采用了四川地区流行的免疫原性良好的两株高毒力HPS。

本试验采用14和35日龄的仔猪，并对其安全性进行检验，结果表明实验制备的HPS二价灭活苗免疫仔猪安全性高。从免疫后抗体效价消长规律可以看出该二价灭活苗可以使猪群产生较高水平的抗体，且维持较长时间。免疫攻毒试验结果（表5和表6）显示攻毒后本实验制备的二价灭活苗组和进口商品疫苗组共20头猪全部存活，国产商品疫苗组死亡2头，而对照组的10头猪全部死亡，表明本研究所制备的二价灭活苗和进口商品疫苗保护率相当，而国产商品疫苗对猪的保护率要低一些。这一结果验证了A.Fuente等[22]的观点，证明HPS灭活疫苗可以有效地控制与制备疫苗相同血清型的细菌的感染。综上所述，本研究选用四川地区流行的HPS制备出二价灭活疫苗，通过仔猪安全性试验、免疫后抗体水平监测及攻毒保护试验等，表明本灭活疫苗安全性高，有较好的免疫原性，对仔猪的免疫保护效力高，能有效预防对应血清型菌株造成的副猪嗜血杆菌病的发生，且灭活疫苗生产工艺简单，无排毒散毒危险，这为副猪嗜血杆菌病疫苗的研制和本病的防控提供了参考。