日照市猪A型口蹄疫检测与疫情风险分析

2018-09-08刘峰

中国畜禽种业 2018年8期

刘峰

（山东省日照市动物疫病预防控制中心 276800）

日照市位于苏鲁交界的黄海之滨，为国家胶东半岛免疫无口蹄疫缓冲区。为了解全市猪A型口蹄疫疫情风险，2018年3月日照市根据全省统一部署开展了对养殖场、屠宰场和无害化处理厂的专项调查。通过深入养猪场查看和流行病学调查发现，猪群整体状况良好，无口蹄疫症状。在未免疫猪A型口蹄疫疫苗的猪场采集了猪血样60份，进行猪A型口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测，未检测到A型口蹄疫抗体；采集了屠宰场、无害化处理厂猪淋巴结和扁桃体各60份，进行猪口蹄疫病毒荧光RT-PCR试验，结果均为阴性。综上所述，日照市目前未发现猪A型口蹄疫病例，但如果疏于日常管理也可能导致疫情发生。

1 检测

1.1 猪A型口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测试验

检测依据∶GB/T18935-2003。

1.1.1 样品概述

采集自未免疫猪A型口蹄疫疫苗的猪场，猪只前腔静脉采血，离心收集血清60份，液体、澄清、浅黄色。

1.1.2 主要仪器

全波长酶标仪（MultiskanGO，美国赛默飞）、电热恒温干燥箱（GZX_9140，上海博迅）、超纯水仪（Cascada，美国PALL），移液器（Biohit，芬兰百得）。

1.1.3 诊断试剂

兰州兽医研究所生产的口蹄疫A型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒，批号：20170906103-2。

1.1.4 检验室环境

温度：25℃，湿度：55%。

1.1.5 检测时间

20180323-20180324。

1.1.6 主要操作步骤

（1）抗原抗体反应：在U型血凝板上将待检血清从1∶16倍比稀释至1∶128，然后每空加稀释的病毒抗原50ul，封板，4℃过夜。（2）ELISA板洗5次，将抗原抗体混合物50ul移至ELISA板上，37℃1h。（3）洗5次，加入50ul豚鼠抗血清，37℃30min。（4）洗5次，加入50ul酶结合物，37℃30min。（5）洗5次，加入50ul底物， 37℃15min。（6）加入50ul终止液，立即在450nm波长读取光吸收值。

1.2 猪口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测试验

检测依据∶GB/T27528-2011。

1.2.1 样品概述

采集自屠宰场、无害化处理厂的猪淋巴结和扁桃体各60份，固体、组织。

1.2.2 主要仪器

II级生物安全柜（AC24，新西兰）、荧光RT-PCR仪（7500，美国 ABI）、移液器（Biohit,芬兰百得）。

1.2.3 诊断试剂

北京生科生产的猪口蹄疫病毒荧光RT-PCR试剂盒，批号： 20170901。

1.2.4 检验室环境

温度：25℃，湿度：55%。

1.2.5 检测时间

2018年3月25日至2018年3月26日。

1.2.6 主要操作程序

（1）样品处理：称样品1g,用手术剪刀剪碎混匀后取0.05g于研磨钵中研磨，加入1.5ml生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5ml灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清200ul置于1.5ml灭菌离心管中。

（2）病毒模板RNA提取：收集200ul样品或阴阳性对照，加入1.5ml灭菌离心管中；加200ulBufferV-L，漩涡振荡混合均匀，静置5min；75ulBufferV-N，A漩涡振荡混合均匀，12000×g离心5min；将上清液转移到新的2ml离心管中，加300ul异丙醇，上下倒置6～8次，混合均匀；将植被管置于2ml离心管中，取上一步的混合液移入植被管，6000×g离心1min；将植被管置回到2ml离心管中，12000×g离心1min，将植被管置于清洁的1.5ml离心管中，在植被管膜中央加60ul-BufferTE，室温静置1min，12000×g离心1min，洗脱RNA。

（3）反应液配制：反应体系按照RT-PCR反应液15ulTab酶0.25ul进行配制，每个反应管中加入上述反应体系15ul，加样10ul，放入仪器中。

（4）荧光 RT-PCR 反应： 42℃30min； 92℃3min； 92℃10s， 45℃30s， 72℃1min， 5个循环； 92℃10s， 60℃30s， 40个循环，荧光收集设备在第四阶段每次循环退火延伸时进行。