李 锐，任丹丹，周建瑜，符华林，刘 畅，申 芸，凡国庆

（四川农业大学动物医学院，成都 611130）

妥曲珠利（toltrazuril）属于三嗪酮类衍生物，是一种广谱抗球虫药物，对巨型、布氏和柔嫩等6种艾美尔球虫都有较强的杀灭作用，广泛用于家禽和哺乳动物球虫病的防治。妥曲珠利临床主要以溶液剂和粉散剂为主[1]，由于妥曲珠利在水中不溶（25℃溶解度为0.41 μg/mL），在胃肠道中的吸收较差，因此限制了临床中的应用。为了增加妥曲珠利的溶解度，相继有妥曲珠利纳米乳[2]、环糊精包合物[3]和固体分散体[4]等报道，有人还研制了妥曲珠利口服溶液[5]，但溶剂为聚乙二醇和丙二醇等，有机溶剂的安全性限制了其使用。这些新剂型虽然在一定程度上改善了药物的溶解度，但纳米乳和固体分散体的稳定性存在质疑，环糊精载体材料比较昂贵，这给妥曲珠利的推广应用带来影响。

纳米胶束是表面活性剂分子聚集形成的纳米聚集体，具有载药量高、粒径小和抗生理稀释作用强等特点，且胶束中的表面活性剂单体对口服药物具有吸收促进作用，因而在药物口服剂型中应用广泛。复合纳米胶束是通过两种或者多种具有协同作用的表面活性剂进行复配的新型胶束，其在改善难溶性药物溶解度、改变药物的药代动力学特性、增加药物在胶束中的稳定性以及减少表面活性剂用量等方面具有更加明显的优势，其中应用较为成熟的复配体系是磷脂/胆盐复合纳米胶束[6-7]，其生物相容性较好，毒性较低，且能显著提高一部分难溶性药物的溶解度和生物利用度，但由于磷脂和胆盐的成本较高，限制了其在兽药制剂中的应用。因此研制新型妥曲珠利纳米胶束对于改善妥曲珠利在球虫病防治中的效果具有重要意义。

1 材料

1.1 药品与试剂

妥曲珠利（含量≥99.0%）、脱氧胆酸钠（NaDC,含量为98%）和Brij C20聚乙烯醚（Brij 58）由上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产；药用级泊洛沙姆188（KolliphorR，P188）、药用级泊洛沙姆407（LutrolRF127）和聚乙二醇单硬脂酸酯由巴斯夫中国有限公司生产；色谱甲醇（含量≥99.9%）、色谱乙腈（含量≥99.9%）和分析纯乙腈（含量≥99.5%）由天津科密欧有限责任公司生产；曲拉通x100（Tx100）由成都科龙化工试剂厂生产。

1.2 实验仪器

LC2010型高效液相色谱仪，岛津国际贸易（上海）有限公司；JJ24BL型电子分析天平，常熟市双杰试剂仪器厂；Millipore超纯水系统，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

2 方法

2.1 妥曲珠利复合纳米胶束的制备

称取妥曲珠利、NaDC、Tx100和Brij58适量，采用适量有机溶剂溶解药物和辅料，混合均匀后在旋转蒸发仪上将有机溶剂蒸发完，再将样品置于真空干燥器中过夜干燥，然后进行水化得到载药复合纳米胶束溶液，最后冻干即得妥曲珠利复合纳米胶束冻干粉。

2.1.1 单因素实验

以载药量和包封率为指标，考察Brij 58、Tx100、脱氧胆酸钠、投药量、水化体积对载药量和包封率的影响。

2.1.2 响应面实验

在单因素的基础之上，采用响应面法考察影响较大的5个因素脱氧胆酸钠用量（mg）、Tx100用量（mg）、Brij 58 用量（mg）、水化体积（mL）和投药量（mg）对妥曲珠利复合纳米胶束的影响，因素水平表见表1，并按照试验设计表进行试验。

表1 因素水平表Table1 Levels of factors

2.2 载药量和包封率测定

根据文献[8]进行改进建立了妥曲珠利的含量测定方法，色谱条件：流动相为甲醇-0.1%的磷酸溶液（84∶16，v∶v），检测波长为 240 nm，柱温为 25 ℃，流速为1.0 mL/min，结果表明该方法用于测定妥曲珠利的含量具有较高的专属性，其中标准曲线为A=49 925×C+18 139（R2=0.999 9），在所测浓度范围内线性关系良好，且具有较高的回收率，精密度实验中的RSD值均小于5%，符合药物含量测定的规定。

精密吸取载药胶束1 mL，加入3 mL乙腈，涡旋震荡2 min，0.45 μm微孔滤器过滤后，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算妥曲珠利的含量。同法测定妥曲珠利原料药在水中的质量。载药量和包封率的计算公式如式（1）、（2）：

其中，ms为妥曲珠利胶束溶液中药物的质量，mw为妥曲珠利在水中的质量，mm为载体材料的质量，mi为妥曲珠利投药量。

本实验在单因素和优化设计的过程中采用综合评分法[9]，计算方法如式（3）：

其中，di为指标的分值，Yi为实测值，Ymax和Ymin分别为各指标的最大值和最小值，各指标分值的平均值可作为综合评价指标，其值越大，表明该处方和工艺越优。

2.3 复合纳米胶束对妥曲珠利增溶效果

将过量的复合纳米胶束冻干制剂样品加入适量的超纯水中，置于37℃水浴振荡器中振摇36 h，取样，微孔滤膜过滤，测定药物含量并计算其饱和溶解度。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 Brij 58用量的选择

由表2可知，随着Brij 58用量的增加，载药胶束的包封率呈现先增加后下降的趋势，这可能是由于Brij58用量增加时水化过程中易发生自聚集，使得其包裹妥曲珠利的效率降低。

表2 Brij 58用量对载药胶束的影响Table2 Effects of Brij58 dosage on drug loaded micelles

3.1.2 Tx100用量的选择

Tx100用量对结果的影响见表3，由表3可知，随着Tx100用量的增加，载药胶束的包封率呈现先增加后下降的趋势，这是因为Tx100浓度过大也会导致Tx100的迅速自聚集，从而导致包封率减小，包封率大幅度变化也会导致载药量的不规律变化。

表3 Tx100用量对载药胶束的影响Table3 Effects of Tx100 dosage of drug loaded micelles

3.1.3 NaDC用量的选择

由表4可知，NaDC用量的波动对包封率的影响较小，而对载药量的影响较大，这可能是因为NaDC为小分子表面活性剂，其疏水端与亲水端均较短，若用量增大形成的自聚集体易发生解离，导致载药量减小。

表4 NaDC用量对载药复合纳米胶束的影响Table4 Effects of NaDC of drug loaded micelles

3.1.4 投药量的选择

由表5可知，包封率随投药量的增加逐渐减小，当投药量大于10 mg时，包封率迅速减小，这是由于表面活性剂所形成的胶束的载药能力有限，投药量的过大会使得复合胶束的包裹效率大大降低，大部分药物沉淀形成晶核，不易被胶束包裹。

表5 投药量对载药复合纳米胶束的影响Table5 Effects of the dosage of the drug loaded nano-micelles

3.1.5 水化体积的选择

由表6可知，随着水化介质用量的增加，胶束的载药量和包封率逐渐递减，这是因为水体积太少时，胶束溶液在转移过程中损失的量就很大使得包封率和载药量变小，但当水化介质的用量为5 mL时包封率达到96.33%，再增加水相体积尽管包封率略有增加，但载药量不变。

3.2 响应面法优化设计

各因素和水平对载药量和包封率的综合影响见表7。利用Design Expert 8.06软件对所得到的数据进行多元回归分析。得到综合评分值（d）对NaDC（A）、Tx100（B）、Brij58（C）、水体积（D）和投药量（E）的二次多项回归模型为：d=0.58-0.023A-7.687×10-3B-0.026C+0.012D+0.14E+0.016AB-1.605×10-3AC+0.023AD+0.067AE+0.042BC-0.013BD+0.030BE+0.017CD+0.11CE+0.027DE-0.057A2+0.011B2-0.011C2-0.024D2-0.069E2。

表6 水化介质体积对载药复合纳米胶束的影响Table6 Effects of the volume of the hydration medium on the drug loaded nano-micelles

响应面的回归分析实验结果见表8，对各项方差来源进行F检验，结果表明模型的F值为32.77，P＜0.01表明该模型极显著，不同处理之间差异显著，模型相关系数R2为0.963 3，说明此模型与试验结果吻合度较高。试验失拟项小说明试验方法可靠能够很好地描述试验结果，使用该方程代替真实的试验点进行分析是可行的。由表8可知，5个因素中，A、C和E的影响差异极显著，因素之间的交互作用中，其交互作用效应图见图 1，AE（如图 1（a））、BC（如图 1（b））和 CE（如图 1（c））的影响差异极显著，BE（如图1（d））和 DE（如图 1（e））的影响差异显著。通过软件分析得到最佳的处方及工艺为：NaDC（149.00 mg），Tx100（198.50 mg），Brij 58（249.00 mg），水化体积（5.58 mL），投药量（14.95 mg）。在此条件下，重复试验3次，包封率和载药量分别为98.63%和3.38%，d值为0.77，与预测值相差3.75%，说明此方程与实际情况拟合较好。

表7 载药复合纳米胶束的响应面法实验结果Table7 Experimental results of the response surface method of composite nano-micelles

（续表7）

表8 方差分析Table8 Variance analysis

（续表8）

3.3 妥曲珠利复合纳米胶束的增溶效果

由表9可知，妥曲珠利复合纳米胶束显著增加了妥曲珠利的饱和溶解度。复合纳米胶束主要是通过不同表面活性剂分子之间的范德华力、氢键和疏水作用等形成的非共价键，疏水端与疏水端相互聚集，水分子通过氢键与亲水端结合，从而减少疏水端形成聚集体后的自由能，最终使得该胶束体系稳定存在[10-11]。妥曲珠利分子被NaDC、Tx100、Brij58这3种表面活性剂包裹，表面活性剂分子与药物之间的相互作用力导致胶束对药物的增溶作用。

图1 各因素相互作用响应面图Figure1 Interaction response surface of each factor

表9 复合胶束冻干制剂复溶后中妥曲珠利的增溶效果Table9 The effects of the solution after dissolution of the dissolution of lyophilized mixed micelles of toltrazuri

4 讨论

NaDC是一种优良的难溶性药物的增溶剂和吸收促进剂，常用于药物剂型的设计中，如脂质体[12]、脂质囊泡[13]、微乳[14]以及胶束[6]等新剂型。我们的研究表明NaDC与Tx100具有较强的协同增溶作用，这种协同作用主要来源于NaDC甾醇结构的α羟基与Tx100的质子受体之间的强烈相互作用[15]。本实验中，NaDC与Tx100之间的协同作用强于Brij58-Tx100和Brij58-NaDC，这是因为NaDC有一个疏水性的环状结构，这个结构与Tx100的苯环之间存在较强的疏水作用力和范德华力，而Brij58为线性分子，与NaDC和Tx100之间的协同增溶能力主要来源于分子间的氢键。综上所述，这3种表面活性剂之间结合导致的强烈的协同作用力主要来自非共价键的疏水作用力、范德华力和氢键。

本研究所制备的复合纳米胶束制剂中的妥曲珠利分子被NaDC、Tx100、Brij58这3种表面活性剂包裹。表面活性剂单体分子通过非共价键的形式在溶液中自组装形成胶团状的纳米级聚集体，其表面和内部的结构紧密有序的形成星形、球形以及蠕虫形等[16]，表面活性剂单体分子不断与胶束的表面活性剂之间进行交换，胶束结构在水溶液中存在是一个动力学平衡过程，其主要的成分和比例具有一定的稳定性[17-18]。复合纳米胶束由于组成成分较多，胶束结构紧凑，表面活性剂分子与药物之间的相互作用力更强，导致胶束对药物的增溶能力更强，因此其载药量更高，进而显著增加药物在水中的溶解度。