于 平，徐超超，朱鹏志

藻蓝蛋白是螺旋藻细胞中产生的一种色素蛋白[1-4]，具有重要的生理功能，其必需氨基酸的含量较高，是一种重要的食品添加剂[5-6]；能够刺激机体产生免疫球蛋白，具有抗肿瘤或抗癌功效；能够促进末端供血和骨髓的造血功能[7-10]；能够减轻盐酸苯肼和辐射合并对小鼠外周血中白、红细胞和骨髓的损伤，降低贫血程度[11]；而且由于其荧光强、量子产量高，易于同生物素和抗体等一些物质结合，作为荧光标记物越来越受到重视[12-15]，因而在食品、药学、医学诊断、临床医学和细胞生物学等领域具有广泛的应用前景。

藻蓝蛋白为结合蛋白[16-17]，目前主要从螺旋藻中分离纯化制备，步骤繁琐、得率低、原料昂贵且浪费严重[18-19]；而且由于螺旋藻养殖条件要求严格，对其室外大规模培养缺乏系统和全面的研究[20-22]，因此藻蓝蛋白的价格十分昂贵，严重制约了其市场拓展，研究和探索新的制备方法已成为当务之急。

在前期研究中，课题组成功地将钝顶螺旋藻藻蓝蛋白生物合成途径的5 个关键基因转化至大肠杆菌，构建了能够高效表达重组藻蓝蛋白的大肠杆菌工程菌[21]。本研究拟对重组大肠杆菌发酵生产藻蓝蛋白培养基的关键介质成分进行优化，确定其最佳培养条件。首先通过部分因素试验设计对影响藻蓝蛋白产量的相关因素进行评价，筛选出具有显著效应的关键因素，然后采用响应面法确定关键因素的最佳质量浓度，以期获得较高的藻蓝蛋白产量，从而为其将来的产业化生产和应用提供良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

重组大肠杆菌工程菌ZJ06，由本实验室构建，包含藻蓝蛋白生物合成途径的5 个关键基因，能够高效合成重组藻蓝蛋白[21]。

蛋白胨、酵母提取物、NaCl、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NH4Cl、异丙基-β-D-硫代葡萄糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG） 生工生物工程（上海）有限公司。

种子培养基：蛋白胨用量16 g/L，酵母提取物用量10 g/L和NaCl用量5 g/L。发酵培养基的组分根据部分因素试验设计和Box-Behnken试验设计确定。

1.2 仪器与设备

UV-2550型紫外-可见分光光度计 日本Shimadzu公司；高速冷冻离心机 美国Sigma公司；HTG-III迴转式恒温调速摇瓶柜 上海欣蕊自动化设备有限公司；FA 2004型分析天平 上海仪器仪表有限公司；DXY-II型恒温调速回转式摇床 上海申安医疗器械厂；DELTA 320型pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；JY92-II超声波细胞粉碎机 宁波新芝科学仪器研究所。

1.3 方法

1.3.1 种子培养

用无菌牙签挑取平板培养基中培养好的单菌落，于无菌条件下接种于装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃恒温摇床中以160 r/min振荡培养48 h，培养物作为摇瓶种子进行接种。

1.3.2 发酵培养

按5%的接种量将摇瓶种子接入装有50 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中，然后将摇瓶置于37 ℃恒温摇床中，160 r/min振荡培养2 h后，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，20 ℃恒温摇床中以160 r/min振荡培养12 h。

1.3.3 部分因素试验

选取蛋白胨、酵母提取物、NaCl、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O和NH4Cl用量7 个因素作为独立考察因素，利用Design-Expert 7.0软件设计3水平部分因素分析，同时加入4 个中心点[22-23]，用于误差分析。试验设计的因素及水平如表1所示。

因素 水平1 0 -1 A蛋白胨用量 30 20 10 B酵母提取物用量 20 12.5 5 C NaCl用量 3.75 2.50 1.25 D K2HPO4·3H2O用量 14 10 6 E KH2PO4用量 8 6 4 F MgSO4·7H2O用量 6.75 4.50 2.25 G NH4Cl用量 8.5 5.5 2.5

1.3.4 Box-Behnken试验设计

根据1.3.3节的试验结果与Box-Behnken试验设计原理，设计3因素5水平共16 个试验点的试验方案，其中14个点是析因点，剩余6 个点为中心复合点。Box-Behnken试验设计中，每个因素取5 个水平，并以（-2、-1、0、1、2）编码各值[23]。对试验数据进行二次回归拟合后，得到带有交互项和平方项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，最后在一定水平范围内预测其最佳值。将预测的最佳响应值重复3 次实验进行验证[24]。试验设计的因素及水平如表2所示。

表2 Box-Behnken试验设计的因素及水平Table 2 Experimental factors and their levels used for Box-Behnken design

1.3.5 藻蓝蛋白含量的测定

藻蓝蛋白质量浓度的测定按照以下方法进行[25]：取10 mL发酵液，5 000 r/min离心5 min，菌体用蒸馏水洗涤2 遍，重悬于1 mL磷酸缓冲液（pH 7.0）中进行超声破碎。超声破碎条件为：功率100 W，工作6 s，间隔6 s，50 次。超声破壁后的菌液于4 ℃、5 000 r/min离心25 min。取上清液测定其在623 nm和650 nm波长处的吸光度。藻蓝蛋白产量的计算如下式所示：

2 结果与分析

2.1 部分因素试验结果

选取N为20的部分因素试验设计对影响重组大肠杆菌发酵生产藻蓝蛋白的培养基的7 个主要组分（蛋白胨、酵母提取物、NaCl、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NH4Cl用量）的重要性进行考察，每个因素取高（1）、中（0）、低（-1）3 个水平。采用Design-Expert 7.0软件分析各因素的效应，并对各因素效应进行t检验，选择置信度大于95%的因素作为显著影响因素作进一步考察[26-28]。试验结果和主效应分析如表3和表4所示。

表3 部分因素试验设计与结果Table 3 Fractional factorial design with response variable

表4 部分因素试验设计的主效应分析Table 4 Analysis of variance for the effects of medium components on phycocyanin yield as per fractional factorial design

部分因素设计的试验结果如表3所示，各因素的主效应分析如表4所示。从表4可以看出，蛋白胨和酵母提取物用量对藻蓝蛋白产量的影响极显著（P＜0.01），K2HPO4·3H2O用量对藻蓝蛋白产量的影响显著（P＜0.05），其他因素对藻蓝蛋白产量无显著影响（P＞0.05）。因此选择置信度大于95%的蛋白胨用量（P＜0.000 1）、酵母提取物用量（P＜0.000 1）和K2HPO4·3H2O用量（P＜0.05）3 个因素进行后续响应面试验，进一步确定其最佳质量浓度。其他因素正效应取高（1）水平，负效应取低（－1）水平。

2.2 Box-Behnken试验设计结果

响应面试验法基本思想是假设一个包括一些未知参量的极限状态函数与基本变量之间的解析表达式代替实际的不能明确表达的结构极限状态函数[29-31]，其中Box-Behnken试验设计是最有效的响应面优化法之一[30-32]。

在上述试验中，通过部分因素试验设计确定了影响重组大肠杆菌发酵生产藻蓝蛋白产量的显著因素为蛋白胨用量、酵母提取物用量和K2HPO4·3H2O用量。利用Design-Expert 7.0软件进行Box-Behnken试验设计，对3 个显著影响因素进行响应面试验，确定其最佳用量。试验的结果与方差分析如表5和表6所示。

表5 Box-Behnken试验设计及结果Table 5 Box-Behnken design with response variable

表6 方差分析结果Table 6 Analysis of variance for the effects of three crucial medium components on phycocyanin yield as Box-Behnken design

运用Design-Expert 7.0软件对试验数据进行多项式回归，以藻蓝蛋白质量浓度（Y）为因变量，蛋白胨用量（A）、酵母提取物用量（B）和K2HPO4·3H2O用量（C）为自变量，得到模型方程：Y=0.14＋7.431A＋6.572B＋0.012C＋4.448AB-1.571AC-6.001BC-3.389A2-3.026B2-9.39C2。

从表6可以看出，该模型的F值为11.26，P值为0.000 4，说明该模型极显著。该模型的失拟项P值为0.065 7，说明该模型失拟项不显著，回归方程的拟合度较好，能够很好地解释试验结果。方程的值为0.910 2，表明该模型能够解释91.02%的藻蓝蛋白质量浓度的变化。

2.3 交互作用对藻蓝蛋白产量的影响

响应面是在所考察的3 个因素中的任意2 个因素水平固定的前提下，以中心组合设计中的响应值为纵坐标，其他因素分别为水平面上的两垂直横坐标所构成的三维模型[33]。两因素相互之间的交互作用对响应值影响显著的模型曲面呈马鞍型，等高线呈椭圆形；反之，则模型曲面呈圆滑型，等高线呈圆形[34-35]。

图1 交互作用对藻蓝蛋白产量影响的响应面和等高线图Fig. 1 Response surface and contour plots showing the interactive effects of various factors on phycocyanin yield

由图1可知，当K2HPO4·3H2O用量不变时，蛋白胨用量和酵母提取物用量两因素的交互作用不显著，表现为响应面圆滑，变化平缓，等高线之间的密度较小，等高线呈圆形。在试验范围内，保持蛋白胨用量不变，随着酵母提取物用量增加，藻蓝蛋白产量逐渐增加；但当酵母提取物用量增加到一定程度后，培养基中的氧和营养物质供给就会受到限制，而且外源蛋白的溶解性、稳定性和代谢产物的积累以及pH值的增加会对菌体产生不利影响，导致藻蓝蛋白产量下降，但变化比较小。保持酵母提取物用量不变，随着蛋白胨用量的增加，藻蓝蛋白产量逐渐增加，然后下降。但随着蛋白胨用量进一步增加，菌种浓度提高到一定数值后就不会再增加，反而溶氧量减少，导致藻蓝蛋白质量浓度下降。当酵母提取物用量不变时，蛋白胨用量和K2HPO4·3H2O用量两因素的交互作用不显著，表现为响应面呈圆滑形，等高线呈圆形，坡度较大，等高线之间的密度较小。在试验范围内，保持K2HPO4·3H2O用量不变，随着蛋白胨用量的增加，藻蓝蛋白的质量浓度增加到最大值，然后下降，这说明培养基中蛋白胨用量对藻蓝蛋白的产量有重要影响。但随菌体细胞浓度的提高，溶氧量等其他因素会导致菌体浓度下降；而且发酵培养基的pH值对菌体的生长和产物的表达也有一定影响，乙酸的积累会抑制细胞的生长。当蛋白胨用量保持不变时，随着K2HPO4·3H2O用量的增加，藻蓝蛋白质量浓度逐渐增大，然后下降。这是由于K2HPO4·3H2O在培养基中主要起调节pH值的功能，pH值会影响酶分子和底物分子的带电状态，从而影响酶的合成，使代谢和细胞透性发生变化。当pH值升高时，藻蓝蛋白的产量也随之增加；但当pH值达到一个最高点时，再升高pH值会导致碱性过大，藻蓝蛋白产量也会降低。当蛋白胨用量不变时，酵母提取物用量和K2HPO4·3H2O用量两因素的交互作用对藻蓝蛋白产量的影响显著。等高线之间的密度较大，呈近似椭圆形，响应面的曲线变化比较大。在试验范围内，保持K2HPO4·3H2O用量不变，随着酵母提取物用量的增加，藻蓝蛋白质量浓度增加到最大值，然后下降。保持酵母提取物用量不变，随着K2HPO4·3H2O用量的增加，藻蓝蛋白含量逐渐增大，然后下降。酵母提取物用量和K2HPO4·3H2O用量两因素之间的交互作用显著，说明藻蓝蛋白质量浓度达到最高点后的下降受两者相互作用的影响，等高线椭圆形的顶点为两者共存时藻蓝蛋白的最高产量。

基于上述模型，运用Design-Expert 7.0软件对回归模型进行分析，寻求藻蓝蛋白产量最大时的稳定点及对应的因素水平，进一步结合三维响应面图和等高线图，可知回归模型存在稳定点，稳定点即最大值。对上述回归方程求偏导，得到藻蓝蛋白质量浓度最高时的3 个因素的编码水平值：A 0.972 5，B 0.674 8和C 0.342，对应的实际用量为蛋白胨用量23.8 g/L、酵母提取物用量13.4 g/L、K2HPO4·3H2O用量9.4 g/L，在此条件下，根据方程预测的藻蓝蛋白质量浓度的最大值为15.96 mg/L。为了验证模型的可靠性，在上述优化条件下，通过3 次验证实验获得的藻蓝蛋白质量浓度的实际最大值为15.28 mg/L，说明该模型能够较好地描述3 个显著因素及其相互作用对藻蓝蛋白产量的影响。

3 讨 论

目前通过构建基因工程菌发酵生产藻蓝蛋白的研究报道较少。文献[18-19]首先构建了2 个重组质粒，其中一个质粒包含cpcA（编码藻蓝蛋白脱辅基蛋白），另一个质粒包含cpcE（编码藻蓝素裂合酶E）和cpcF（编码藻蓝素裂合酶F），然后将这2 个质粒转化至大肠杆菌，再通过重组大肠杆菌的培养和体外添加藻蓝素的方法，实现了藻蓝蛋白的表达。但由于质粒的不相容性或相容性较差，含有2 个质粒的重组大肠杆菌在培养过程中，容易造成质粒丢失，从而使得重组菌株的遗传稳定性差，其最终表达量也未见后续报道[21]。Tooley等[20]用大肠杆菌表达了重组藻蓝蛋白脱辅基蛋白，然后再通过体外添加藻蓝素分子的方法合成了完整的藻蓝蛋白。但藻蓝素分子与脱辅基蛋白交联过程中所涉及到的化学反应以及使用有毒的硫光气液体，不仅会对环境造成污染，而且制备的藻蓝蛋白的生物活性和纯度也较低。本研究所采用的基因工程重组大肠杆菌菌株ZJ06，是将藻蓝蛋白生物合成途径的5 个关键基因全部构建到一个表达质粒中，并在此基础上优化了基因的排列方式和基因之间的间隔距离，该工程菌能够高效合成重组藻蓝蛋白，不需要额外添加藻蓝素分子，且遗传稳定性好[21]。

外源蛋白重组表达时，其产量易受培养基组分的影响[22-23]。本研究采用响应面法优化了所构建的重组大肠杆菌发酵生产藻蓝蛋白的培养基组分，发现了蛋白胨用量、酵母提取物用量和K2HPO4·3H2O用量对藻蓝蛋白产量有明显的影响，并进一步优化了其最佳用量。蛋白胨在培养基中起的作用主要是提供氮源，它不仅含有丰富的氨基酸，特别是含硫氨基酸较多，而且含有更多的细菌生长所需要的维生素和其他生长因素[22]，因此可以影响菌种浓度，进而影响藻蓝蛋白的产量。酵母提取物的主要作用是补充碳源和提供微生物生长所需的各种生长因素，可改善菌种的繁殖率[23]，进而影响藻蓝蛋白的产量。K2HPO4·3H2O在培养基中主要起调节pH值的作用，pH值会影响菌体的生长及其产物的生物活性，较高的初始pH值对菌体生长过程中产生的乙酸存在一定的调节作用，进而促进菌体的生长与产物的表达[24]。通过培养基组分的优化，最终获得的重组藻蓝蛋白的产量为15.28 mg/L。该研究结果为藻蓝蛋白的产业化生产和应用提供了良好基础。但是，除了培养基组分外，培养条件，例如温度、装液量和摇床转速等，也是影响重组大肠杆菌发酵生产藻蓝蛋白的重要因素，有关这方面的影响有待于进一步深入研究。

4 结 论

本研究主要采用响应面法优化重组大肠杆菌发酵生产藻蓝蛋白的培养基的关键介质组分，以提高藻蓝蛋白的产量。首先通过部分因素试验设计，对影响藻蓝蛋白产量的7 个相关因素进行评价，筛选出了3 个具有显著效应的因素；然后采用响应面法确定主要影响因素的最佳用量。筛选出的3 个具有显著效应的因素为蛋白胨用量、酵母提取物用量和K2HPO4·3H2O用量，其最佳用量分别为23.8、13.4 g/L和9.4 g/L，在此条件下获得的藻蓝蛋白的实际质量浓度的最大值为15.28 mg/L，取得了较好的试验结果。