曹晶晶，顾丰颖，罗其琪，刘子毅，王 锋*

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种非蛋白质氨基酸，是动物及人体中枢神经系统中重要抑制性传递物质[1]。GABA通过调节中枢神经系统，具有降血压的作用，其舒缓血管和降血压的药理功效已在大量的动物实验和临床医学中得以证实[2-3]，同时具有镇静神经、抑制抑郁的功效[4]。植物性来源的GABA产品因其安全性、天然性的特点备受关注，目前富含GABA食品有发芽米、发芽豆、谷物早餐产品等[5]。

在植物体内GABA主要通过谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）催化谷氨酸（glutamic acid，GA）脱羧生成，其中GAD催化是其产生的主要限制性途径[6]。GAD是一种磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）-关联酶，其活性被PLP提升[7]。GAD是一种Ca2＋/钙调蛋白依赖型的酶，具有一个钙调蛋白结合区[8]，外源添加Ca2＋可提高GAD活性，促进GA转化为GABA[9]。

发芽糙米是富含GABA植物性食品之一，也是开发GABA功能食品主要原料。发芽处理是一种有效改善谷物食用品质和营养价值的方法，可大大提高产品的生物利用率。在浸泡发芽过程中，内源性酶被生产或激活，分解淀粉及蛋白质等主要大分子，产生一些次生代谢物，如GABA和酚醛物质[10]。浸泡和发芽处理能够显著增加糙米中GABA含量[11]，发芽过程中的环境压力对GABA含量增加有显著促进作用，如厌氧胁迫、低压等离子体照射、热激处理等[12-14]。逆境对细胞内部产生破坏，降低细胞质pH值，从而有利于GA脱羧而不利于GABA转氨，从而显著增加植物体内GABA含量[15]。超声波处理是一种常用的逆境胁迫处理方式，通过一定频率的机械振动，适当强度的超声波作用于糙米，具有提高酶活、促进细胞生长和生物合成的作用，可促进部分营养成分含量增加[16-17]。

目前关于发芽糙米中GABA的研究主要集中在发芽条件的优化，对于GABA形成的酶及底物之间的关系研究较少。因此，本实验主要研究糙米发芽不同阶段的GA含量、GAD活性及GABA含量变化，同时考察超声波对发芽糙米GABA含量的影响，探究发芽糙米中GA含量、GAD活性与GABA含量三者之间的关系，为提高发芽糙米的生理功效提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糙米品种为五优稻4号，由黑龙江北纯农产品开发有限公司提供，粳型常规水稻。2016年10月收获，室温密封保存。

GABA标准品、PLP 美国Sigma-Aldrich公司；β-巯基乙醇 美国Amresco公司；盐酸（优级纯），无水乙醇、乙二胺四乙酸、GA（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DYJ-Y01糙米发芽机 中山市长益家用电器有限公司；FD-1C-80冷冻干燥机 上海比朗仪器制造有限公司；KQ-600DE超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TTL-DCII型氮吹仪 北京同泰联科技发展有限公司；L-8900氨基酸分析仪 日立高新技术公司。

1.3 方法

1.3.1 糙米浸泡预处理

在肖君荣等[18]的方法上作适当改动，糙米用1%次氯酸钠浸泡10 min消毒，用去离子水冲洗3 次沥干。糙米在发芽前进行浸泡3 h预处理。预处理条件为30 ℃营养液（2.5 mmol/L Ca2＋浓度，pH 5.5）浸泡3 h。

1.3.2 制备糙米发芽

糙米预处理结束后，采用糙米发芽机30 ℃至发芽结束，每隔12 h更换一次营养液。在发芽至不同时间点进行超声波处理。超声波处理条件：参考张祎等[19]的方法，适当改动，将糙米置于注有营养液的器皿中，在30 ℃、40 kHz、240 W条件下超声波处理15 min。超声波处理不计入总发芽时长。具体处理条件如表1所示。

表1 超声波处理方式Table 1 Conditions for ultrasonic treatment

在发芽过程中第0、12、24、36、48、60、72小时取出部分样品，用蒸馏水冲洗3 次沥干，冷冻干燥至水分质量分数小于10%。磨粉，过80 目筛，4 ℃贮藏待测。

1.3.3 指标测定

1.3.3.1 GABA及游离氨基酸含量测定

在Chen Huahan[14]和Komatsuzaki[20]等方法基础上作适当调整。称取1.0 g发芽糙米粉，加入5 mL去离子水，超声提取30 min。8 000 r/min离心，取上清液，重复提取1 次，合并上清液。取3 mL上清液，加入7 mL无水乙醇于4 ℃过夜沉淀，离心收集上清液，氮吹至干。加入1 mL 0.02 mol/L盐酸溶液溶解干燥物，10 000 r/min离心10 min，上清液即为GABA粗提液。过0.22 μm滤膜，采用氨基酸自动分析仪测定GABA和16 种游离氨基酸（除色氨酸和半胱氨酸）含量。其中GABA质量浓度C（mg/mL）与峰面积A之间的回归方程为A=5.84×108C＋127 176（R²=0.999 8），具有良好的相关性。

1.3.3.2 GAD活性测定

在白青云[21]和Khwanchai[22]等测定方法基础上作适当调整。取2.00 g发芽糙米，加入10 mL的磷酸钾缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.2），内含2 mmol/L β-巯基乙醇、2 mmol/L乙二胺四乙酸、0.2 mmol/L PLP，4 ℃、250 r/min提取12 h。10 000 r/min冷冻离心20 min，上清液为粗酶提取液。取0.5 mL粗酶液，加入200 μL底物溶液（50 mmol/L GA）和1.8 mL磷酸钾缓冲液（0.05 mol/L，pH 5.8），内含2 mmol/L β-巯基乙醇、2 mmol/L乙二胺四乙酸、0.2 mmol/L PLP。于37 ℃反应1 h后90 ℃水浴10 min反应灭酶，离心，取1 mL反应液氮吹干燥。加入5 mL 0.02 mol/L盐酸溶液溶解干燥物，按照1.3.3.1节方法测定GABA含量。GAD活性定义：在37 ℃每克干质量样品每分钟产生的GABA量（nmol）表示。

1.4 数据处理

采用Origin 8.0软件绘图，SPSS 16.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），P值小于0.05则认为组间差异显著。

2 结果与分析

2.1 发芽糙米GA含量测定结果

图1 超声波处理糙米发芽过程中GA含量变化Fig. 1 Change in GA content during brown rice germination under ultrasonic treatment

浸泡预处理后，对照组糙米中GA含量为7.20 mg/100 g。由图1可知，随发芽时间的延长，发芽糙米中GA含量持续增加，主要来源于糙米发芽代谢促使蛋白质水解[20]。超声波处理组发芽糙米中GA含量明显高于对照组。其中处理1在发芽0 h时GA含量是对照组的1.78 倍，处理2在发芽12 h时GA含量是对照组的1.88 倍，且处理组在12～24 h之间GA含量较对照组高2 倍左右，表明超声波促进酶激活，加快了蛋白质降解速率[23]，促使GA含量增加；在36 h之后，处理1较处理2发芽糙米中GA含量稍高。在发芽60 h后，GA含量增幅减缓，在后萌发阶段糙米呼吸强度增大，干物质消耗量加剧，GA消耗量增加[24]。

GA含量随着发芽时间的延长持续增加，而Xu Jianguo等[25]发现在裸燕麦富集GABA前期，GA含量随着发芽时间的延长持续减少。分析认为，游离性GA主要来源于蛋白质分解[7]、谷氨酰胺合成酶循环、GABA转氨酶反应[6]3 种途径，GA的转化途径主要是合成GABA、合成其他氨基酸或氧化分解。因此，产生游离性GA的速率要大于GA转化的速率。

2.2 发芽糙米中GAD活性测定结果

图2 超声波处理糙米发芽过程中GAD活性变化Fig. 2 Change in GAD activity during brown rice germination under ultrasonic treatment

糙米经浸泡处理后，对照组GAD活性为7.09 nmol/g。在发芽0～48 h之间，对照组GAD活性均值为9.25 nmol/g。糙米历经72 h的发芽，GAD活性呈现先增后降再增趋势。对照组在发芽第36小时达到第1个峰值11.20 nmol/g，在60 h达到谷值7.43 nmol/g，GAD活性降低34%。Xu Jianguo等[25]研究发现GAD活性有类似变化，变化量受燕麦品种影响。韩超等[26]发现米胚芽中GAD活性存在峰值，GA浓度为50～100 mmol/L时达到最大值。处理1在发芽初始GAD活性是对照组的1.11 倍，说明在发芽初期即在水分吸收阶段（吸胀作用），表明超声波处理更有助于GAD激活[16]；在发芽第24小时达到第1个峰值11.13 nmol/g，在第60小时GAD活性降低至最低值5.83 nmol/g。处理2与处理1类似，GAD活性值在发芽第24小时达到峰值，在发芽第60小时达到谷值。超声波处理将GAD活性第1个峰值提前了12 h。超声组在60 h后，GAD活性增加幅度明显增大，且高于第1个峰值。温焕斌[24]发现糙米发芽至60～84 h蛋白酶活性明显提高。糙米在发芽72 h左右已结束萌发阶段，并开始进入幼苗形态建成过程[27-28]。处理1、2之间在糙米发芽过程中对GAD变化无明显差异，但2 种超声波处理都使GAD激活进程提前，缩短发芽时间。

Scott-Taggart等[29]的研究表明，GAD活性受GA调节。Dennison等[30]发现南芥体中GA除可自身激活GAD外，还可通过改变细胞质中Ca2＋浓度而影响GAD活性。结合图1可知，在24～36 h间GA增加量较大，GAD活性较高，在48～60 h间处理组GA含量基本保持不变，GAD活性降低。表明发芽糙米中GAD活性受GA含量调节。

2.3 发芽糙米中GABA含量测定结果

图3 超声波处理糙米发芽过程中GABA含量变化Fig. 3 Change in GABA content during brown rice germination under ultrasonic treatment

糙米浸泡预处理后，对照组GABA含量为6.84 mg/100 g。由图3可知，随发芽时间延长，发芽糙米中GABA含量持续增加，在发芽第72小时，达到68.75 mg/100 g，且在发芽第36小时后，增长速度明显加快。结合图1，发芽糙米中GA含量在12～24 h增长幅度缓慢，产物GABA含量在24～36 h时增幅减缓，GABA增加量受GA含量调节，时间稍有延后。结合图2，在0～36 h间，GAD活性升高到1.60 倍，GABA含量增加到3.56 倍；在36～60 h间GAD活性下降明显，GABA增加到1.69 倍，GABA增加量受GAD活性调节。

GABA含量在超声波处理后较对照组低，GABA是游离氨基酸，超声波处理加速游离氨基酸溶出[31]。与对照组相比，发芽糙米24～48 h之间GABA含量明显增加，超声波能够促进GAD激活[32]，进而促进GABA含量的增加。但在48～60 h GABA无明显增加，GABA是三羧酸循环支路的重要中间产物[7]。植物体中GABA由GAD催化GA脱羧得到[6]。在GABA支路中，GABA通过转氨基作用转化为琥珀酸半醛，并进一步转化成琥珀酸，从而进入三羧酸循环[33]。结合图2，GAD活性在48～60 h阶段较低，直接限制了GABA含量增加，使GABA增加量不明显。

在糙米发芽后期GABA含量增长幅度明显增大，因超声波加快了糙米发芽进程，此时糙米提前结束萌芽，进入幼苗形态建成过程，游离氨基酸等小分子物质增加[27-28]。Zhang Yungang等[34]发现超声波能量作用于酶分子，可使酶分子的构象发生改变，进而改变酶的生物活性。同时超声波促进植物细胞壁周围物质降解，细胞内Ca2＋和H＋浓度增加，由于GAD是钙调素蛋白，可以有效激活GAD活性，促进GABA在发芽过程中的积累。超声波处理在发芽第36小时之前较对照组能增加GABA含量，在发芽12 h处理较0 h进行超声波处理效果较好；超声波处理只对发芽前期有作用，在中后期无显著差异。糙米发芽过程中GABA含量变化主要取决于糙米自身发芽代谢。

2.4 发芽糙米中游离氨基酸含量变化

表2 超声波处理发芽过程中游离氨基酸总含量的动态变化Table 2 Change in free amino acids contents during brown rice germination under ultrasonic treatment mg/100 g

浸泡预处理后糙米中游离氨基酸含量为42.09 mg/100 g。超声波处理后游离氨基酸总量明显增加，表明超声促进糙米中蛋白质水解。随发芽时间延长，大部分游离氨基酸（除天冬氨酸、丝氨酸外）含量持续增加，游离氨基酸总量由42.09 mg/100 g增加至336.11 mg/100 g。但2 种超声波处理对发芽后期游离氨基酸含量增加无显著促进作用。

2.5 GABA含量相关性分析

表3 超声波处理糙米发芽过程中GABA、GAD活性和GA相关性分析Table 3 Correlation analysis between GABA, GAD activity, and GA during brown rice germination under ultrasonic treatment

为更清楚探明在浸泡和发芽过程中GABA、GAD及GA之间的相互关系，进行相关性分析见表3。3 种不同处理方式下的糙米在发芽过程中GABA与GA之间呈显著正相关（P＜0.05）；但GAD活性与GABA和GA的相关性较低（P≥0.05）。GABA和GA呈显著正相关是因为随着时间延长两者都是呈增加趋势。

通常情况下，GABA含量随GAD活性增加而增加，反之亦然[35]。本研究中GABA与GAD没有显著相关性，但Liu Liu等[36]发现GABA含量与GAD活性之间呈显著正相关。Komatsuzaki等[37]发现外源添加GA可以调控GAD活性和GABA含量。Li Yan等[38]发现，在植物组织中GABA含量不仅受GAD活性的影响，还受到其他因素如GA含量、GABA转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶影响。此外，Su Guoxing等[39]发现大豆中的GABA积累与多胺的氧化有关，受二胺氧化酶的活性增加影响。所以发芽糙米中GABA含量和GAD活性之间的关系还需进一步研究。

3 结 论

本研究借助超声波逆境胁迫，采用浸泡发芽增加糙米中GABA含量，分析GA含量、GAD活性与GABA含量之间的关系。随着发芽时间延长，GAD活性呈先增加后降低再增加的趋势；在发芽0～48 h之间，对照组GAD活性均值为9.25 nmol/g，GABA含量增加到6 倍以上；在48～60 h之间，GABA含量增加量不明显，GABA含量受GAD活性调节。在发芽过程中GABA和GA含量随着发芽时间延长两者均呈递增趋势，且二者之间呈显著正相关（P＜0.05）。

2 种超声波处理方式在糙米发芽12 h后显著增加了GABA含量，加快了GAD激活进程；显著提高GA含量，达到对照组的2 倍以上；在发芽前期对GABA含量有显著增加，对发芽后期GABA影响不明显。在糙米发芽前期超声波对其他种游离氨基酸含量有显著促进作用；但2 种不同超声波处理时间点之间的差异不显著，糙米发芽过程中GABA含量变化主要取决于糙米自身发芽代谢。

综上，发芽糙米中GABA形成受GAD活性调节，并与GA含量呈显著正相关，超声波处理对糙米发芽过程中GAD活性、GA含量有显著影响，并有助于增加发芽糙米中GABA含量。然而，GA、GABA含量与GAD活性之间复杂的代谢途径的关系还不清楚，仍需更进一步研究。