王雅宁 蔺 超 刘云启 高金祥 刘益涛 高 洁

(滨州医学院附属医院肾内科,山东 滨州 256603)

在长期腹膜透析过程中，腹膜结构和功能的改变与腹膜血管生成密切相关，越来越多证据表明，腹腔局部血管内皮生长因子(VEGF)的上调是其中心环节〔1，2〕。成人VEGF主要通过与其受体VEGFR1(Flt-1)、VEGFR2(Flk-1/KDR)结合发挥生物学效应。此外，Flt-1基因尚编码一种可溶性的形式sFlt-1，其与VEGF有很强的亲和性，与之结合后即阻断VEGF的一系列分子生物学效应〔3〕。与长期腹膜透析腹膜损害有关的诸多因素，如透析液的生物不相容性、葡萄糖降解产物(GDP)、腹腔慢性炎症等均可影响腹腔局部VEGF表达〔4〕。本文旨在探讨不同腹膜透析液对大鼠腹膜间皮细胞(RPMCs)VEGF及其受体表达及分泌的影响。

1 材料和方法

1.1材料 清洁级SD雄性大鼠，体重150～180 g，由山东大学实验动物中心提供。主要试剂：DMEM/F12培养基、DMEM培养基、胎牛血清(FBS，美国Gibco)，Trizol试剂(Ambion公司)，腹膜透析液(美国Baxter公司)，RT试剂盒(Fermentas公司)，鸡抗大鼠VEGFR2抗体(Prosci公司)，兔抗大鼠VEGFR1抗体(Labvison公司)，小鼠抗大鼠GAPDH抗体、小鼠二抗、兔二抗(美国CST公司)，鸡二抗(Upstate公司)，鼠VEGF及sFlt-1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(R&D公司)。

1.2RPMCs的分离培养及鉴定 取SD雄性大鼠，腹腔内注射含0.25%胰酶及0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液进行消化。120 min后无菌操作下剖开大鼠腹腔，吸取腹腔内液体，置15 ml离心管，1 500 r/min离心10 min，弃上清。DMEM/F12(含0.5%FBS)洗涤1次，离心弃上清。加入含12%FBS的DMEM/F12培养基，将细胞打散为均匀悬浮液，接种于25 cm2培养瓶中，置于37℃ 5% CO2培养箱中培养。待90%～95%细胞融合，消化传代。第2代细胞经形态鉴定及抗细胞角蛋白抗体、抗Ⅷ因子抗体免疫组织化学鉴定，确定为腹膜间皮细胞后，用于下游试验。

1.3不同腹膜透析液对RPMCs VEGF及其受体表达的影响 稳定培养的第1代RPMCs消化传代，同步化培养24 h后，分别以不同腹膜透析液〔1.50%葡萄糖腹膜透析液(dextrose)(低糖组)、2.50% dextrose(中糖组)、4.25% dextrose(高糖组)、7.50% icodextrin(糊精组)〕进行刺激培养，无血清DMEM为阴性对照(对照组)，刺激24 h后收集细胞，提取核酸及蛋白以供检测。

1.4RT-PCR检测RPMCs的VEGF、VEGFR1、VEGFR2和sFlt-1 mRNA表达 冲洗RPMCs后，按照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，随后取2 μg RNA，按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。基因序列通过GenBank获得，引物设计由PRIMER5.0软件按照引物要求完成，由上海英骏公司合成。VEGF：上游 5′-CCACGACAGAAGGGGAGCA-3′，下游5′-ACACCGCATTAGG GGCACA-3′；VEGFR1：上游5′-CAAGGGACTCTACAC TTGTC-3′，下游5′-CCGAATAGCGAGCAGATTTC-3′；VEGFR2：上游5′-GCCAATGAAGGGGAACTGAAGAC-3′，下游5′-TCTGACTGCTGGTGATGCTGTCA-3′；sFlt-1：上游5′-AATCTGCTCGCTATTCGGTG-3；下游5′-GTGGGTAGAGAGGTGGGCTT-3′；GAPDH：上游5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。反应结束后取10 μl PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭(EB)染色，凝胶成像系统成像及进行扫描定量分析，以其所测得积分吸光度与内参照GAPDH积分吸光度的比值代表半定量值。

1.5Western印迹检测RPMCs的VEGFR1、VEGFR2蛋白表达 裂解细胞后，置于冰上，4℃ 10 000 r/min离心10 min，收集上清，测蛋白浓度。取20 μl总蛋白上样于7%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分离，湿法转膜，5%脱脂奶粉室温1 h。分别加入兔抗大鼠VEGFR1抗体，鸡抗大鼠VEGFR2抗体，小鼠抗大鼠GAPDH抗体，4℃孵育过夜。以辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应二抗孵育1 h，洗膜；电化学发光(ECL)显影，自动成像系统成像并分析。

1.6ELISA检测RPMCs培养上清中VEGF及sFlt-1蛋白表达 收集细胞培养上清，离心去除细胞碎片。15 min内加完所有样本，具体步骤按照说明书进行。

1.7统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1大鼠腹膜间皮细胞的培养和鉴定 常规培养的大鼠腹膜间皮细胞生长至融合状态后呈现多边形、菱形、椭圆形，大小不等，具有典型的鹅卵石状或铺路石样上皮细胞形态，抗大鼠角蛋白(Keratin)、波形蛋白(Vimentin)阳性，证实为腹膜间皮细胞见图1。

图1 大鼠腹膜间皮细胞的鉴定

2.2各组RPMCs VEGF及其受体mRNA表达 中糖组、高糖组VEGF、VEGFR1、sFlt-1 mRNA表达水平显著高于低糖组、糊精组及对照组(均P<0.01)，低糖组与糊精组明显高于对照组(均P<0.05)，低糖组与糊精组差异无统计学意义(P>0.05)。中糖组、高糖组VEGFR2 mRNA表达显著低于低糖组、糊精组及对照组(均P<0.01)，低糖组与糊精组VEGFR2 mRNA表达低于对照组(P<0.05)，低糖组与糊精组差异无统计学意义(P>0.05)，见表1，图2。

图2 各组RPMCs的VEGF、VEGFR1、sFlt-1和VEGFR2 mRNA表达

组别VEGF mRNAVEGFR1 mRNAsFlt-1 mRNAVEGFR2 mRNA对照组0.236±0.0191)0.118±0.0111)0.131±0.0121)1.234±0.1091)低糖组0.578±0.0231)2)0.203±0.0181)2)0.364±0.0321)2)0.882±0.0651)2)中糖组0.976±0.1100.685±0.0490.782±0.0510.276±0.019高糖组1.146±0.2140.981±0.0780.912±0.1160.193±0.012糊精组0.553±0.0421)2)0.211±0.0211)2)0.385±0.0141)2)0.891±0.0861)2)

与中糖及高糖组比较：1)P<0.01;与对照组比较：2)P<0.05

2.3各组RPMCs VEGF及其受体蛋白表达比较 Western印迹法结果显示，中糖组、高糖组VEGFR1蛋白表达水平显著高于低糖组、糊精组及对照组(均P<0.05)，低糖组与糊精组差异无统计学意义(P>0.05)；中糖组、高糖组VEGFR2蛋白表达显著低于低糖组、糊精组及对照组(均P<0.01)，低糖组明显低于对照组(P<0.01)；ELISA结果显示，中糖组、高糖组VEGF、sFlt-1表达水平显著高于对照组(P<0.05)，高糖组显著高于低糖组及糊精组(P<0.05)，低糖组与糊精组差异无统计学意义(P>0.05)，见图3，表2。

图3 各组RPMCs的VEGFR1和VEGFR2蛋白表达

组别VEGF(pg/ml)sFlt-1(pg/ml)VEGFR1VEGFR2对照组236.7±25.4113.1±27.30.142±0.0120.703±0.081低糖组325.3±30.2123.2±21.60.245±0.0270.452±0.0273)中糖组437.2±33.74)152.8±25.44)0.487±0.0321)4)0.211±0.0182)3)高糖组528.1±36.51)4)198.7±36.11)4)0.602±0.0461)4)0.122±0.0102)3)糊精组318.0±28.9121.9±19.90.250±0.0150.649±0.059

与低糖组及糊精组比较：1)P<0.05,2)P<0.01;与对照组比较：3)P<0.01,4)P<0.05

3 讨 论

在腹膜透析过程中，腹腔长时间暴露于传统的含糖腹膜透析液可引起腹膜功能改变、腹膜间皮细胞丢失、血管增生及腹膜纤维化，血管增生可导致腹膜有效表面积增大，溶质转运系数增加，最终导致超滤衰竭〔5〕。研究表明，腹腔局部VEGF的上调是其中心环节〔6，7〕。动物模型表明，高乳酸盐浓度、转化生长因子(TGF)-β1、低pH等均可促使腹膜血管生成、VEGF合成增加。Bajo等〔8〕证实，用传统的腹透液刺激腹膜间皮细胞后，E-钙黏蛋白(cadherin)表达减少，细胞形态发生改变，VEGF表达增加，而接受低GDP腹透液刺激的细胞则无上述变化。VEGF家族成员包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(PLGF)，其中VEGF-A(通称VEGF)是目前发现最为重要的血管生成正性调节因子，主要通过结合VEGFR1(Flt-1)和VEGFR2(Flk-1/KDR)发挥分子生物学效应〔9，10〕，此外，Flt-1基因仅由选择性剪切的6个Ig区域组成，与VEGF有很强的亲和性。VEGF与受体结合后可迅速增加细胞内Ca2+水平，通过磷酸肌醇特异性磷脂酶C途径，使细胞内IP3水平升高，促进新生血管生成、增加血管通透性。Io等〔11〕研究发现，腹膜组织中VEGF及VEGFR-1 mRNA表达增加，在第21和35 d达到高峰，与本文结果趋势一致。Zhang等〔12〕在尿毒症患者腹膜血管壁检测出了VEGFR1和VEGFR2，且VEGFR2与腹膜微血管密度、小分子溶质转运速率及24 h腹膜蛋白排泄密切相关，提示VEGFR2可能是腹膜基线转运特征的重要决定因子。与本研究结果不同，可能与体内检测的是腹膜组织总VEGFR2表达，而本研究仅检测腹膜间皮细胞VEGFR2表达有关。此外，由于sFlt-1缺乏酪氨酸激酶结构域，没有信号转导功能，当sFlt-1出现后与VEGFR1竞争PLGF、VEGF，与VEGFR2竞争VEGF，也是细胞接受刺激后VEGFR2下调的原因〔13〕。最近研究显示，VEGF的高水平可预测患者的全因死亡率，升高的sFlt-1与炎症因子可联合增加患者全因死亡率的风险；此外，sFlt-1同内皮细胞损伤的标志物细胞间黏附分子(ICAM)-1、血管细胞黏附分子(VCAM)-1正相关，VEGF和sFlt-1同C反应蛋白及白细胞计数相关〔14，15〕，提示VEGF及sFlt-1通过促使炎症细胞趋化参与炎症过程〔16〕，其潜在的病理生理学作用可能为在细胞激活过程中，使其更容易受到炎症因子的攻击，甚至同炎症因子有协同作用〔17〕。糊精腹膜透析液含7.5%多聚葡萄糖，由谷物淀粉水解后产生，其85%分子量在16 800～45 000 D，只有6%分子量小于16 800 D。由于其分子量较大，不能通过腹膜上的小孔吸收，只能通过液体的对流缓慢吸收，故能长时间维持有效渗透压浓度，在高转运及高平均转运患者能改善超滤〔4，18〕，且由于其渗透浓度低，较少形成糖基化终产物，故较dextrose生物相容性更好〔19〕，此外，有研究证实，糊精腹膜透析液能更好地保护残余肾功能〔20〕。有文献报道，7.5% icodextrin也会使腹膜间皮细胞增殖和活力下降，细胞内活性氧增加，细胞功能下降，但和1.5% dextrose调节水平一致，且低于4.25% dextrose〔19〕，与本文结果趋势基本一致。笔者推测，7.5% icodextrin对于VEGF系统的调节是其生物相容性较好的机制之一。综上，腹膜透析液能显著上调VEGF及其受体VEGFR1、sFlt-1的表达，下调VEGFR2的表达，以2.5% dextrose及4.25% dextrose 最为显著，7.5% icodextrin对VEGF及其受体的调节水平低于2.5% dextrose及4.25% dextrose，从新的角度证实了icodextrin具有良好的生物相容性，但VEGF的受体在透析液刺激下发生上述变化的意义还待动物模型证实。