张俊萍 魏 征

(河南省中医药研究院，河南 郑州 450004)

化瘀解毒方是河南省中医药研究院附属医院内部制剂，临床运用治疗肺癌多年，取得了良好的疗效。本研究以人肺癌A549细胞为研究对象，对其进行体外实验研究，探讨化瘀解毒方抗肺癌的作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料 化瘀解毒方药免煎颗粒剂杜氏改良培养基(DMEM培养基)、胎牛血清，GIBCO，美国；噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)，Sigma，美国；青霉素、链霉素，晶美生物科技有限公司，中国；Matrigel 基底膜基质胶(Becton，Dickinson and Company，美国)；抗-蛋白激酶B(Akt)(#4691)，抗-3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶(PDK)1(#5662)，抗-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)(#4225)，抗-磷酸化(p)Akt(#4058)，抗-p-PDK1(#3061)，抗-p-PI3K(#4228)和抗-甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(#5174)，山羊抗兔IgG，Cell Signaling Technology，美国)；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量试剂盒(Thermo，美国)；预染蛋白Marker(Fermentas，美国)；聚偏氟乙烯(PVDF)转移膜(Millipore，美国)。

1.2实验仪器 医用X光胶片(Fujifilm，日本)，超净工作台(苏州净化设备有限公司，中国)，酶标仪(Bio-Rad，USA)，TY-80B 脱色摇床(武汉格莱莫检测设备有限公司，中国)，细胞培养箱(Thermo，美国)，X光洗片机(江苏省泰兴市泰龙医用设备厂，中国)。Transwell 板(Costar，美国)，实时定量PCR 扩增仪(ABI，美国)，核酸定量仪(Thermo，美国)。

1.3样品准备 按照复方中的比例，分别称取半枝莲61.00 g、广木香19.52 g、鸡内金19.52 g、三七9.76 g、全蝎6.10 g、壁虎6.10 g。加8倍量水进行回流提取，提取2次，合并提取液，浓缩，烘干至浸膏状，冷冻干燥机进行冻干处理，得粉末，上述粉末粉碎过100目筛，细粉称重。蒸馏水倍比稀释成含生药1 g/ml的水煎剂，冷却装入灭菌药瓶，置4℃冰箱备用。环磷酰胺(CTX)粉针剂：江苏恒瑞医药股份有限公司生产，200 mg/支，与0.9%氯化钠溶液配置制20 mg/ml的溶液，4℃冰箱保存。

1.4含药血清制备 大耳白兔12只，随机分为化瘀解毒方药高剂量组、低剂量组、CTX组、生理盐水组，每组3只。实验前禁食12 h，根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”〔1〕，化瘀解毒方药高、低剂量组分别用每天15、30 g/kg剂量口服灌胃；生理盐水组给予相同剂量的生理盐水1次/d，连灌1 w；CTX组第1天予20 mg/kg腹腔注射，后6 d给予等剂量生理盐水灌胃。于末次给药后1 h，无菌条件下心脏采血，分离血清，56℃、30 min下补体灭活，-20℃保存备用。

1.5细胞培养 肿瘤细胞株均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。在37℃、5% CO2条件下，于含100 U/ml 青霉素、100 U/ml链霉素和10%胎牛血清的 DMEM 培养液中培养。

1.6细胞增殖抑制实验 分别取对数生长期的A549细胞计数，接种于 96 孔培养板中，每孔4×103个细胞。培养 24 h后，分别加入生理盐水组、化瘀解毒方药高、低剂量组、CTX组的含药血清，空白对照组加入等体积的胎牛血清，每个浓度3个复孔。继续培养12～72 h后，每孔加入10 μl MTT(4 mg/ml)，继续培养4 h，弃上清，每孔加入200 μl DMSO，振荡混匀，用酶标仪在 570 nm 处测定吸光度值(OD570)，计算抑制率。公式：抑制率(%)=(1-给药组OD570/空白对照组OD570)×100%。

1.7细胞黏附实验 96孔板底部孵育5 mg/ml matrigel，每孔200 μl，4℃过夜待用。取不同对数生长期的A549细胞，计数，接种于96 孔培养板中，每孔4×103个细胞。培养 24 h后，以不同浓度的化瘀解毒方提取物处理不同时间。在96孔板中孵育3 h后，细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍去除未贴壁的细胞。每孔加入 5 mg/ml MTT，每孔10 μl，37℃孵育4 h。去除上清液，每孔加入200 μl DMSO 溶解结晶，570 nm处检测吸光度。计算黏附细胞百分比。

1.8细胞迁移实验 采用Transwell细胞培养系统检测细胞迁移。在37℃下，Transwell板上腔下表面包被fibronectin(10 μg/ml)2 h待用。A549细胞经不同浓度化瘀解毒方提取物处理48 h后，混悬于无血清培养液中加入上腔。下腔加入含20%胎牛血清的培养液。24 h后用结晶紫染色检测迁移至下表面的细胞数。显微镜下计数细胞数，每组至少5个视野。计算迁移率，迁移率=给药组/溶剂对照组×100%。

1.9细胞侵袭实验 采用Transwell细胞培养系统检测细胞侵袭。Transwell板上腔加入5 mg/ml matrigel，每孔100 μl，37 ℃下孵育4 h待用。A549细胞经不同浓度化瘀解毒方提取物处理48 h后，处理的细胞混悬于无血清培养液中加入上腔。下腔加入含20%的胎牛血清培养液。24 h后，用结晶紫染色检测侵袭至基质内的细胞数。显微镜下计数细胞数，每组至少5个视野。计算侵袭率，侵袭率=给药组/溶剂对照组×100%。

1.10细胞总RNA提取 取对数生长期的A549细胞，接种于6孔板中。24 h后，不同浓度化瘀解毒方提取物处理A549肿瘤细胞株12 h。弃6孔板中上清培养液，加入1 ml Trizol试剂反复吹打细胞后，加入200 μl氯仿。混匀，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液，加入同体积异丙醇，混匀，12 000 r/min离心10 min。沉淀用70% 乙醇洗1遍，加入无核酸酶的水溶解RNA。用核酸分析仪检测RNA浓度及其质量。

1.11RNA反转录及实时定量PCR 取对数生长期的A549细胞，接种于6孔板中。24 h后，A549细胞株经不同浓度化瘀解毒方提取物处理，12 h后采用Trizol提取A549细胞总RNA。采用TaKaRa反转录酶进行反转录。采用Beacondesigner4.0软件设计引物。扩增条件：预变性50℃ 2 min；变性95℃ 10 min；延伸：95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，收集荧光信号，在该阶段扩增40个循环；第4步做溶解曲线。经绘制标准曲线验证，各个产物的扩增效率以目标基因与β-actin扩增产物的双 Delta-C比值分析，计算各组的相对表达情况。

1.12免疫印迹分析 取对数生长期的A549细胞，接种于6孔板中。24 h后，A549肿瘤细胞株经不同浓度化瘀解毒方提取物处理12 h后弃6孔板中上清液，用冰浴的PBS洗涤，在冰上用组织细胞快速裂解液(RIPA)缓冲液抽提。离心取细胞裂解液进行蛋白定量，上样缓冲液煮样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后采用半干法转到硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜用含有5%奶粉的Tris缓冲盐溶液(TBS)封闭过夜，添加一抗37℃孵育4 h，TBST(含Tween-20的TBS)洗膜，二抗孵育1 h，TBS洗涤之后电化学发光法(ECL)显色，洗片。选用GAPDH作为内参，1∶400稀释。

1.13数据处理和分析 采用SPSS20.0软件行单因素方差分析(ANOVA)。

2 结 果

2.1化瘀解毒方含药血清对A549细胞增殖的影响 终浓度为5%、10%和20%的化瘀解毒方含药血清作用48 h剂量依赖性抑制A549肿瘤细胞增殖。其中低剂量组抑制率分别为29%、46%和64%，高剂量组为42%、61%和82%。结果说明，通过代谢后的化瘀解毒方含药血清可以有效抑制A549肿瘤细胞增殖，具有较好的抗肿瘤作用。见图1。因此，后续实验选择化瘀解毒方含药血清的终浓度为10%，作用为48 h。

图1 化瘀解毒方含药血清剂量依赖性抑制A549肿瘤细胞增殖

2.2化瘀解毒方含药血清对A549细胞黏附的影响 低剂量和高剂量的化瘀解毒方含药血清均可抑制A549肿瘤细胞的黏附能力。其中，生理盐水组含药血清处理过的A549细胞中39%具有黏附能力，而经过低剂量化瘀解毒方含药血清处理48 h的A549细胞23%黏附至底板。而高剂量化瘀解毒方含药血清处理48 h的A549细胞的黏附能力与CTX组大致相同，均为15%黏附至底板。结果说明，化瘀解毒方含药血清可以较强地抑制A549细胞黏附。

2.3化瘀解毒方含药血清对A549细胞迁移的影响 在相同放大倍数的视野下，71个生理盐水组血清处理的细胞迁移至腔室下表面。低、高剂量含药血清组和CTX组均能显著抑制A549细胞迁移，迁移至腔室下表面的细胞数分别为41、18和23。说明化瘀解毒方含药血清可以抑制A549肿瘤细胞的迁移。见图2。

图2 化瘀解毒方含药血清抑制A549细胞迁移(×100)

2.4化瘀解毒方含药血清对A549细胞侵袭的影响 相同倍数放大视野下，45个生理盐水组血清处理的细胞侵袭至基质中。然而，低、高剂量含药血清组和CTX组均能显著抑制A549细胞侵袭，侵袭至基质中的细胞数分别为28、15和14。说明化瘀解毒方含药血清可以抑制A549肿瘤细胞的侵袭。见图3。

图3 化瘀解毒方含药血清抑制A549细胞侵袭(×100)

2.5化瘀解毒方含药血清对细胞中Akt通路的影响 实时定量PCR结果显示，化瘀解毒方含药血清不影响A549细胞中PI3K，PDK1和Akt mRNA的表达，说明化瘀解毒含药血清不能通过抑制Akt信号通路中相关基因的转录而抑制肿瘤细胞的增殖。见图4。免疫印迹结果与实时定量PCR结果一致，化瘀解毒方含药血清和CTX对PI3K、PDK1和Akt蛋白水平无影响；然而，化瘀解毒方含药血清显著抑制A549细胞中Akt蛋白的磷酸化水平，说明化瘀解毒方含药血清抑制A549细胞增殖、黏附、迁移和侵袭与抑制Akt蛋白的磷酸化有关。见图5。

图4 化瘀解毒方含药血清对A549细胞中PI3K,|PDK1和Akt mRNA表达的影响

图5 化瘀解毒方含药血清对A549细胞中Akt通路蛋白表达的影响

3 讨 论

在中医学文献中，虽无肺癌的病名，但对其体征和症状却早有载录。如《灵枢·胀论》谓“肺胀者，虚满而喘咳”。《素问·玉机真藏论篇》谓：“大骨枯槁，大肉陷下，胸中气满，喘息不便，内痛引肩项，身热脱肉破”。《东医宝鉴》曰：“痈疽发于内者，当审脏腑，如中府隐隐而痛者，肺疽也”，以“疽”字论定了肺癌的恶变性质。肺癌属中医的“咳嗽”、“咯血”、“胸痛”等范畴，古又有“肺积”、“痞癖”、“息贲”、“肺壅”之称〔2〕。古代医家对肺癌的病机分为正虚、邪实两个方面〔3〕。《医宗必读》所言：“积之成也，正气不足，而后邪气踞之”。《疡科心得集》中提到“癌瘤者，非阴阳正气所结肿，乃五脏瘀血、浊气痰滞而成”。现代医家对肺癌的病因病机认识的侧重点不同，但也分为正虚、邪实两个方面。虽历代医家没有明确提出瘀毒之名，但从“癥积”“噎嗝”“石瘕”“岩证”等病的病因、病理、证候特点、治疗预后等方面的描述，论述了“瘀毒”的部分内容。笔者认为，肺癌是以“瘀毒”为标、“元气亏虚”为本，将肺癌的中医证候、病因病机概括为“瘀毒”〔4〕。肺癌瘀毒是由于元气衰败，不能行血运津，复因情志、外感、饮食、劳倦等因素，形成顽痰、死血，痰血积久不去，化火成毒所致。瘀与癌毒往往相伴而生，两者具有同源互生的关系，形成癌毒的环境条件，同样也是促成血瘀形成的环境条件，在血瘀的状态下，癌毒更易形成，癌毒与血瘀等邪气共同作用癌瘤更易发生，癌毒和癌瘤的存在又可进一步加重血瘀的发展和变化。因而，肺内癌毒一旦形成，不仅阻隔经络气血，且掠夺水谷精微以自养，导致五脏六腑失却气血津液濡润，逐渐衰竭，而出现咳喘、痰中带血、胸闷胸痛、气短、消瘦乏力等症。化瘀解毒方由全蝎、壁虎、三七、半枝莲、广木香、鸡内金组成。其中全蝎、壁虎活血解毒为君；辅以三七活血化痰、软坚散结；佐以半枝莲解毒抗癌，使以广木香理气和胃、疏畅气血。诸药合用，共奏活血解毒、软坚散结、扶正抗癌之功。临床治疗症瘕痞块积证，常选用搜剔破瘀之力较强的虫类药，以达到破瘀血、消积块的目的。

PI3K的活性与多种人类肿瘤的发生息息相关。PI3K/Akt通路关键分子的抑制可以诱导其细胞周期阻滞，周期相关蛋白表达降低，诱导肿瘤细胞凋亡。本实验结果显示：化瘀解毒方提取物呈浓度依赖性抑制体外人肺癌A549肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。虽然化瘀解毒方含药血清对PI3K，PDK1和Akt总蛋白水平无影响，但显著抑制A549细胞中Akt蛋白的磷酸化水平。因此，考虑化瘀解毒方的作用机制可能与抑制PI3K/Akt通路有关，但需要进一步探索。