刘佳慧，刘 阳，王冬梅

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2. 西北民族大学 实验中心，甘肃 兰州 730030)

氧化和自由基的产生是机体衰老和疾病的最大威胁[1].糖尿病、心脑血管疾病、慢性肾功能衰竭、缺血-再灌注损伤、肿瘤以及衰老等均伴有氧应激.植物中有效成分的药理及对人类的保健作用等的研究已成为中药材研究领域的热点.植物天然总黄酮类物质具有降血糖、降血脂、抗骨质疏松、抗氧化和消除自由基等生物活性作用，还可降低罹患结肠癌、前列腺癌、乳腺癌等癌症的风险[2，3].植物提取物具有安全、稳定、可控、无毒等优点，因此，从植物中寻找高效、廉价、无毒的天然抗氧化剂已成为目前保健医学发展的一个必然趋势[4].

蒲公英[1](Taraxacum officnala)别号婆婆丁、丁奶奶、灯笼草及奶汁草等，是一种多年生草本植物和中药材[5].其性味苦寒，具有消痛散结和利尿的作用，为中医传统清热解毒药物，赋有“天然抗生素”的美称.蒲公英富含各类维生素及矿物质，如钾、镁、铁、钙、铜等，含有多种活性成分，如生物碱类、有机酸类及黄酮类化合物等，报道具有抗肿瘤、防衰老、降血糖、降血脂等药理功用[2，5]，国内外均有对蒲公英整株抗氧化性的研究.

本实验以本地产蒲公英的根为实验材料，提取根中的总黄酮类物质，对提取物的体内抗氧化性活性进行了探讨，以期为本地蒲公英中生物活性物质的研究和开发利用奠定一些实验基础.

1 材料与方法

1.1 原料、试剂与仪器

蒲公英：于9月底采摘于兰州某高校榆中校区，依据《中国药物志》本地生蒲公英属药用蒲公英(T. officnala).试样预处理：经恒温干燥、粉碎后置于干燥容器中备用.

试验动物：健康雄性小鼠36只，雌鼠24只，用基础饲料适应性喂养1周后，随机分为六组，每组雄鼠6只，雌鼠4只.分组后记录每只体重约19 ～ 22g.

超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒；芦丁、D-半乳糖、乙醇、乙醚、硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯试剂.

设备及器材：干燥烘箱，离心机，电热恒温水浴锅，紫外可见光分光光度计，粉碎机，玻璃匀浆器等.

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁的标准曲线

采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色体系测定[6].分别移取芦丁标准品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0ml与25ml容量瓶中，初加30%乙醇至12.5ml，加入5% NaNO21ml，6min后加入10% Al(NO3)31ml，6min后加1mol/L NaOH 10ml，再用30%乙醇定容，摇匀，15min后以空白试剂为参比，510nm波长处测定吸光度.以芦丁浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线.

1.2.2 蒲公英根总黄酮的提取

将采集的蒲公英根清洗晾晒，65℃干燥烘箱中烘干36h后粉碎，过80目筛，每次准确称取蒲公英根粉末5.0g，放入圆底烧瓶中，加入200ml无水乙醇，用索式提取法50℃下萃取2h，将所得溶液用旋转蒸发仪蒸馏[2]浓缩得到总黄酮粗提取物.提取物中总黄酮定量以芦丁为标准品，采用显色体系进行定量测定[7].总黄酮物质的提取率计算公式：

提取率/%=C×V×n/m×100%

公式中，n:提取液稀释倍数；C:被测液中黄酮类物质浓度(g/mL)；V:提取液体积(mL)；m:蒲公英干粉的质量(g).

1.2.3 动物抗氧化实验

实验设计共六组，分别为阴阳性对照组、模型组和给药组.阳性对照组、模型组和给药组皮下注射D-半乳糖300mg/(kg·d).造模同时各组灌胃给药，小鼠每天灌胃一次，连续28天；阳性对照组芦丁100mg/(kg·d)灌胃，阴性对照组灌等量生理盐水，给药组以分别高、中、低剂量提取物(50mg /(kg·d)、150mg /(kg·d)、300mg/(kg·d)灌胃.

1.2.4 测试样品的处理和指标检测

动物喂养结束后，禁食12 h，摘眼球取血，3000 rpm离心5 min分离血清备用[5].颈椎脱臼法处死小鼠后无菌取出小鼠肝脏，用冰冷的生理盐水洗涤数次，滤纸吸干水分，称取0.5g放入无菌平皿中剪碎，转入玻璃匀浆器，加相应试剂盒中的提取液5ml，冰浴匀浆为10 % 的肝组织匀浆，4℃、8000g离心10min，取上清液置冰上待用.

小鼠血清和肝组织各指标的检测方法参照试剂盒说明.超氧化物歧化酶(SOD)活力采用羟胺法；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)活力测定采用比色法；丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)测定法.

1.2.5 数据分析

2 结果与分析

2.1 蒲公英根总黄酮的提取

芦丁标准溶液在509nm处有最大吸收峰，以芦丁浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线见图1.

拟合得回归方程:Y=0.0744X+0.2946，R2=0.9995.蒲公英根总黄酮的提取率6.55%.董默[8]报道的蒲公英提取率为4.33%.本实验总黄酮提取物的提取率较高，原因可能与取样仅为蒲公英根部有关，有研究[6]认为蒲公英整株中根的总黄酮含量最高.

2.2 提取物对SOD、GSH酶活性和MDA的影响

衡量抗氧化能力常用的指标有超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)[7].用不同剂量蒲公英根的提取物对小鼠灌胃给药后，提取物对小鼠血清和肝组织中SOD、GSH酶活性和MDA的影响，结果见表1～3.

图1 芦丁的标准曲线

表2 提取物对小鼠血清和肝组织中GSH-Px的影响(x±S，n=10) (x±S，n=10)

表3 提取物对小鼠血清和肝组织中MDA相对含量的影响(x±S，n=10)

从表中的实验数据可以看出，实验中衰老小鼠的模型造模是成功的.模型组与阴性对照组相比，小鼠的血清和组织中的SOD、GSH-Px的酶活力均下降显著，MDA含量上升明显(P<0.05).

超氧化物歧化酶( SOD) 是体内一种重要的氧自由基清除剂，对机体的氧化与抗氧化平衡有着重要的作用.体内自由基水平失衡时会导致肿瘤、衰老、炎症等各种疾病[3]，SOD 能清除超氧离子自由基 O2-·，保护细胞免受损伤，其活力的高低与疾病的发生发展有着密切的关系.实验数据显示：低剂量给药组和阴性对照组之间无显著差异(P>0.05)，中、高剂量组和阳性对照组显著高于阴性对照组(P<0.01)，蒲公英根提取物浓度与SOD活性呈正相关，酶的活性随提取物浓度的增加而升高.中高剂量蒲公英根提取物可明显提高小鼠血清和肝脏中SOD活性.

过氧化脂质(LPO)是自由基对不饱和脂肪酸引发的脂质过氧化作用的最终产物，其含量的多少反映组织细胞的脂质过氧化速率或强度.GSH-Px是细胞内抗脂质过氧化作用的酶性防御体系的主要成分，可催化LPO分解生成相应的醇，防止LPO均裂和引发脂质过氧化作用的链式支链反应，减少LPO的生成以保护机体免受损害.本实验中，提取物低剂量给药组与阴性对照组间GSH-Px活性无显著差异(P>0.05)，中、高剂量组GSH活性显著高于阴性对照组(P<0.01)，蒲公英根提取物对GSH活性的影响呈正相关.根提取物可清除脂类氢过氧化物，清除H2O2.

丙二醛(MDA)是体内脂类过氧化物的主要代表，其水平的高低可以反映体内不饱和脂质的过氧化程度，间接地反映机体产生自由基的水平和细胞膜的损伤程度[8].实验数据显示，各处理组与阴性对照组中小鼠肝脏和血清中MDA的影响存在显著差异(P<0.01)，低剂量组与阳性对照组之间无显著差异(P>0.05)，随着提取物浓度与MDA的含量呈负相关.

近年来研究表明糖尿病和高血压、慢性肾功能衰竭、缺血-再灌注损伤等以及衰老均伴有氧应激.GSH-Px活性降低可能是动脉粥样硬化发生的独立危险因素，与动脉粥样硬化、原发性高血压、心肌炎等均密切有关[2，3，11].GSH-Px降低还可能与脑智力发育障碍，大脑缺血、缺氧损伤、神经变性及重金属中毒有关.综合分析实验数据，阳性对照组与提取物中、高剂量给药组中，小鼠血清和组织中的SOD、GSH-Px的酶活力、MDA含量相近，这些实验组与模型组比较，实验结果差异显著(P<0.05)，说明中、高剂量的蒲公英根总黄酮提取物和芦丁有相似的作用，能抵抗由D-半乳糖引起的衰老现象.

植物中有效成分的药理及对人类的保健作用等的研究已成为中药材研究领域的热点[8].虎眼万年青、银杏叶、蒲公英、姜黄素和某些中草药提取物中活性成分，如皂苷、生物碱、总黄酮、萜类内酯、有机酸类、糖类、氨基酸类、香豆素类等的抗氧化研究均有文献报道[9-11].

本实验中，蒲公英根总黄酮的提取率达6.55%，中、高剂量根提取物可有效地提高机体内SOD、GSH-Px的酶活力、降低MDA水平，说明甘肃本地生蒲公英根中总黄酮类物质的含量较高，有较好的抗自由基、抗衰老的活性.作为天然抗氧化剂的来源，本地区蒲公英根有一定的开发和利用价值.