曹敏，向钦，刘阳，何明忠，赖国旗，衣启营

(重庆医科大学实验动物中心，重庆 400016)

CBA小鼠是实验动物的常用品系，1920年Leonell C. Strong通过对雌性Bagg小鼠A和雄性DBA小鼠交配后，进行近交培育成功，命名为CBA。1932年引入英国，次年Bonser进行分离近交获得近交CBA/Ca亚系。1948年CBA/Ca被引入杰克逊实验室而命名为CBA/CaJ。CBA/CaJ具有遗传基因纯合，个体差异小，对试验反应均一，试验结果更准确可靠等特点[1]，目前已被我国引入并逐渐应用于医学生物学[2-11]等方面的相关研究。与其他近交系小鼠相比，因常用的基础生物学数据缺乏，限制其广泛应用。小鼠的生长发育、生理生化以及免疫功能等生物学指标是评价动物是否健康的重要依据，尽管已有其他小鼠的基础生物学数据部分报道，但由于动物品种、品系及饲养条件等因素的影响，不同品系的小鼠，甚至同一品系不同性别、不同龄期的小鼠，其生物学数据差异较大[12]。鉴于目前国内尚未见CBA/CaJ小鼠生物学指标的相关文献报道，本研究对幼龄(6周龄)和成年(12周龄)的CBA/CaJ小鼠的主要脏器重量、血液生理生化值、免疫细胞比例等指标进行了测定，建立了CBA/CaJ小鼠生物学指标的标准，研究结果为拓展该品系动物进行生物医药、药品安全性评价等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级CBA/CaJ小鼠4 ～ 8周龄，雌雄各5只，由南京大学国家遗传工程小鼠资源库【SCXK (苏) 2015-0001】引进，其温度、相对湿度、换气次数、明暗周期等符合中华人民共和国国家标准(GB 14925-2010)。小鼠的饲料为北京科澳协力饲料有限公司生产的SPF大小鼠生长繁殖饲料。根据Chou等[2]的报道，选取幼龄(6周龄)和成年(12周龄)的CBA /CaJ小鼠各32只，雌、雄比例为1∶1，共计64只。每组随机抽取6只，共24只进行免疫细胞检测；其余40只用于脏器系数和血生理生化指标检测。动物实验于重庆医科大学实验动物中心实验室进行【SYXK(渝)2017-0023】。

1.1.2 试剂及仪器

免疫细胞抗体(CD3，CD4，CD8a，CD19，B220，NK1.1及CD11b)购于Invitrogen by Thermo Fisher Scientific公司。全自动生化分析仪以及配套试剂IDEXX Catalyst DXTM；全自动血液分析仪PE-6800 VET；台式高速冷冻离心机HeraeusTMFrescoTM21 Microcentrifuge；流式细胞仪FACS caliber BD；分析天平Sartorius BS210 s。

1.2 实验方法

1.2.1 体重和脏器重量的测定

实验前禁食12 h，禁水1 h，称取小鼠体重，然后，眼眶采血后脱颈椎处死，立即剖取心脏、肝、脾、肺、肾，滤纸吸干表面液体，剔除脏器表面脂肪和筋膜后称重。

1.2.2 血液生理指标测定

从小鼠眼眶后静脉丛采血，取0.1 mL血液到 EDTA 抗凝管内，进行20项血液生理指标测定，分别为：白细胞 (WBC) 总数、淋巴细胞比率(LYM%)、中间细胞比率(MID%)、粒细胞比率(NEUTR)、淋巴细胞(LYM)、中间细胞(MID)、粒细胞(GC)、红细胞(RBC)总数、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、血红蛋白含量(MCH)、血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞分布宽度SD(RDW-SD)、红细胞分布宽度CV(RDW-CV)、血小板(PLT)总数、血小板平均体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、血小板压积(PCT)、血小板大细胞比率(P-LCR)。

1.2.3 血液生化指标测定

将全血置于生化分析IDEXX Catalyst容器内，进行10项血液生化指标测定，分别为:血尿素氨(BUN)、肌酐(CREA)、钙离子(CA)、白蛋白(ALB)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALKP)、总胆红素(TBIL)、胆固醇(CHOL)、肌酸激酶(CK)。

1.2.4 免疫细胞检测

取小鼠外周血，分别置于3支EDTA抗凝管中备用，其中一管加FITC-CD3、PE-CD4和APC-CD8a，一管加FITC-CD19、PE-B220和APC-NK1.1，最后一管加FITC-CD11b避光室温静置15 min，然后每管加入溶血素使红细胞溶解并释放出血红蛋白。充分震荡混匀，避光室温静置10 min。洗后用流式细胞仪检测，并用FCS Express V3.0 软件分析数据。免疫细胞检测指标: T 细胞(CD3+、CD4+、CD8a+)、B细胞(CD19+、 B220+)、NK细胞(NK1. 1+)、粒细胞(CD11b+)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 CBA/CaJ小鼠脏器测定

由表1分析可见，6周龄的CBA/CaJ小鼠，雄鼠的体重、心脏、肝、肺和肾重量均显著高于雌鼠(P< 0.05)，且体重、心脏、肺和肾差异有显著性(P< 0.01)。12周龄CBA/CaJ小鼠，雄鼠体重、心脏、肝和肾重量均显著高于雌鼠(P< 0.01)。雌性CBA/CaJ小鼠，6周龄小鼠的心脏重量明显低于12周龄小鼠(F=0.068，P=0.003)。雄性CBA/CaJ小鼠体重，心脏和脾均低于12周龄小鼠(P< 0.05)，且体重和心脏差异有显著性。相比，CBA/CaJ小鼠(雌性+雄性)12周龄体重和心脏显著高于6周龄(P< 0.01)。其余脏器重量差异无显著性。见表1。

表1 CBA/CaJ小鼠主要脏器重量Table 1 The organ weights of CBA/CaJ n=12, g)

注：Ⅰ表示6周龄雌鼠，Ⅱ表示6周龄雄鼠，Ⅲ表示12周龄雌鼠，Ⅳ表示12周龄雄鼠。同周龄小鼠雌雄相比，“a”表示差异有显著性P< 0.05，“A”表示差异有极显著性P< 0.01；同性别、不同周龄小鼠相比，“b”表示差异有显著性P< 0.05，“B”表示差异有极显著性P< 0.01。下表同。

Note. Ⅰ represents 6-week old female mice. Ⅱ represents 6-week old male mice. Ⅲ represents 12-week old female mice. Ⅳ represents 12-week old male mice. Compared with the male and female mice of the same age, “a” meansP< 0.05, and "A" meansP< 0.01. Compared with the different ages of the same gender, “b” meansP< 0.05, and "B" meansP< 0.01.(The same in the following Tables)

2.2 CBA/CaJ小鼠血液生理指标测定

由表 2分析可见，6周龄的雌雄CBA/CaJ小鼠相比，NEUTR、LYM、HGB、MCV、MCHC、RDW、PLT、PDW、PCT 和P-LCR的值差异有显著性 (P< 0.05)，其中MCV、MCHC、RDW、PLT和P-LCR差异有极显著性(P< 0.01)。12周龄的雌雄小鼠，LYM、GC及NEUTR差异有显著性(P< 0.05)。雌性小鼠，6周龄小鼠MCV、MCH及RDW的值显著高于12 周龄小鼠(P< 0.01)。雄性小鼠，6周龄与12周龄小鼠LYM%、MID%、GC及NEUTR、HCT、MCV、MCH、MCHC、RDW、PLT、PCT及P-LCR值差异均有显著性(P< 0.05)，其中LYM%、NEUTR、MCV、MCH、MCHC、RDW、PLT及PCT差异有极显著性(P< 0.01)。相比，CBA/CaJ小鼠LYM%，HGB和PLT 6周龄均显著高于12周龄(P< 0.05)，而HCT、MCV、MCH、RDW-SD和RDW-CV差异有显著性(P< 0.01)。见表2。

2.3 CBA/CaJ小鼠血液生化指标测定

由表 3 分析可见，6周龄小鼠，雄鼠BUN、ALT和CHOL 的值高于雌鼠(P< 0.05)，且BUN和CHOL差异有极显著性(P< 0.01)。12周龄的CBA/CaJ小鼠，雌雄鼠ALKP和CHOL的值差异有极显著性(P< 0.01)。雌性的CBA/CaJ小鼠，6周龄与12周龄小鼠 BUN、ALKP、TBIL和CK 的值差异有显著性(P< 0.05)，且BUN、ALKP差异有极显著性(P< 0.01)。雄性的CBA/CaJ小鼠，6周龄与12周龄小鼠 BUN、ALB、ALKP、CHOL及CK 的值差异有显著性(P< 0.05)，且BUN、ALKP及CHOL值差异有极显著性。所有小鼠的CREA均小于或等于0.2 mg/dL。相比，CBA/CaJ小鼠BUN和TBIL 6周龄均极显著低于12周龄，而CK极显著高于12周龄(P< 0.01)。其余指标差异无显著性。

表2 CBA/CaJ小鼠血生理指标测定结果Table 2 The blood physiological parameters of CBA/CaJ

表3 CBA/CaJ小鼠血生化指标测定结果Table 3 The blood biochemical parameters of CBA/CaJ

2.4 CBA/CaJ小鼠血液免疫细胞测定

由表4分析可见，6周龄的CBA/CaJ小鼠，雌雄小鼠免疫细胞比例差异无显著性。12周龄的CBA/CaJ小鼠，雄鼠的NK1.1细胞比例略高于雌鼠(P< 0.05)。部分CD19和B220免疫细胞部分流式结果见图1。其他细胞比例差异无显著性。CBA/CaJ小鼠6周龄与12周龄相比，显示各指标差异均无显著性。见表4。

表4 CBA/CaJ小鼠免疫细胞比例结果Table 4 The immune cell proportion of CBA/CaJ

注：A表示6周龄雌鼠CD19细胞比例；B表示6周龄雄鼠CD19细胞比例；C表示12周龄雄鼠CD19细胞比例；D表示12周龄雌鼠CD19细胞比例；E表示6周龄雌鼠B220细胞比例；F表示6周龄雄鼠B220细胞比例；G表示12周龄雄鼠B220细胞比例；H表示12周龄雌鼠B220细胞比例。图1 CBA/CaJ小鼠CD19和B220免疫细胞百分比Note: A means the proportion of CD19 cells in 6-week old female mice. B means the proportion of CD19 cells in 6-week old male mice. C means the proportion of CD19 cells in 12-week old male mice. D means the proportion of CD19 cells in 12-week old female mice. E means the proportion of B220 cells in 6-week old female mice. F means the proportion of B220 cells in 6-week old male mice. G means the proportion of B220 cells in 12-week old male mice. H means the proportion of B220 cells in 12-week old female mice.Figure 1 The CD19 and B220 immune cell percentages of CBA/CaJ mice

3 讨论与结论

CBA/CaJ小鼠作为一种实验动物，已被应用到乙肝病毒感染模型研究[2]，白血病模型[3]，听觉研究动物模型[4-7]，生殖免疫模型[8]，视觉研究[9-10]以及自身免疫性甲状腺炎的研究[11]等人类疾病动物模型的建立及药物评价中[13-19]，CBA/CaJ小鼠在医学生物学及农业科学研究中的应用价值备受关注。虽然在JAX网站上可查询到CBA/J小鼠的生理生化指标，但由于JAX实验室与我国国标中小鼠饲养标准和微生物控制等标准不尽相同，且目前国内尚未见有关CBA/CaJ小鼠的主要脏器系数，血生理生化指标以及免疫细胞等基础生物学数据的报道，而这些指标，是否发生改变并不可知，并且这些指标都是动物实验中的重要参考数据。在新药临床应用前，脏器重量是毒理学研究中评价受试药物毒性作用的重要指标[20-21]，对确认药物毒性作用的靶器官具有重要意义[22]。血液生理生化值和免疫细胞比例不仅是种属标准化鉴定的依据，也是医学生物学研究的基础指标和临床医疗的基础数据[23]。

本研究测定幼龄和成年CBA/CaJ小鼠的主要脏器重量、20项血生理、10项血生化指标以及免疫细胞比例。结果表明，同周龄的CBA/CaJ小鼠的雌雄相比，体重、心脏、肝、肾重量差异具有显著性，与吴旭颖等[24]检测的BALB/cA-nu小鼠研究结果相比，除心脏重量外其他结果一致，且两品系小鼠相比，其脏器重量都具有一定差异；同其他小鼠(BALB/c、KM、NIH)[25]相比较，脏器重量均有差异。不同周龄的雌性CBA/CaJ小鼠相比较，20项生理指标有4项差异有显著性；不同周龄的雄性小鼠相比较，生理指标有13项差异有显著性，其中8项差异有极显著性；6周龄不同性别的CBA/CaJ小鼠相比较，20项血液生理指标有11项差异有显著性，与席晓霞等[26]报道结果比较，其中MCHC及MCV与BALB/c一致，RDW及PTL与C57BL/6一致，RDW与DBA/2一致。12周龄不同性别的CBA/CaJ小鼠相比较，生理指标差异无显著性。不同周龄和性别的CBA/CaJ小鼠相比较，血液生化指标有一定差异；6周龄雌雄小鼠同席晓霞等[26]报道的6 ～ 8周龄三个品系小鼠比较，BUN、ALT及CHOL生化指标与BALB/c和C57BL/6一致，BUN和CHOL与DBA/2一致。免疫细胞比例检测结果发现，12周龄雌雄小鼠的NK1.1细胞比例有一定差异，其他免疫细胞指标差异无显著性，鉴于CBA/CaJ小鼠的T细胞，B细胞， NK细胞和粒细胞等免疫细胞都占一定比例，所以CBA/CaJ小鼠品系是一种免疫活性的小鼠，这与吴旭颖等[24]报道的BALB/cA-nu是一种T细胞特异性免疫功能缺陷的小鼠研究结果不同。

总之，不同周龄和性别的CBA/CaJ小鼠之间比较及与其他品种品系小鼠相比，脏器重量、血液生理生化指标及免疫细胞比例均存在一定的差异，这些差异可能是品种、品系、性别及龄期不同等原因所致。在基础医学的生物学研究中，要充分考虑到品种、品系、性别和龄期对实验动物基础生物学指标的影响。本研究中获得的CBA/CaJ小鼠的基础生物学数据为今后我国利用该品系动物从事生物医药及兽药研究等科研工作奠定基础。