赵丹丹， 郭 展， 李 曦， 张永强， 张 莉， 朱五福， 郑鹏武△， 杨丹凤△

(1. 江西科技师范大学药学院 南昌 330013； 2. 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所， 天津 30050)

近年来，随着灰霾、雾霾天气的普遍发生，空气污染尤为严重。2013年10月，国际癌症研究机构(IARC)已将室外大气污染列为人类致癌物之一[1]。大气颗粒物是空气环境中化学成分最复杂、人群危害最严重的污染物之一。按空气动力学直径，可将颗粒物划分为：可吸入颗粒物(PM10，空气动力学直径<10 μm)、细颗粒物(PM2.5，空气动力学直径<2.5 μm)和超细颗粒物(ultrafine particles, UFPs，空气动力学直径<0.1 μm)，其中超细颗粒物所占总颗粒数的比率可达到92%[2]。流行病学调查和毒理学研究显示，颗粒越小毒性越大，尤其是UFPs。近年来，在轮胎、橡胶产品、非橡胶产品以及颜料和油墨的生产、制作等多个领域纳米炭黑颗粒的应用逐渐增多，使得人们在研究、生产、消费和环境中接触纳米炭黑颗粒的机会也迅速增多。研究表明，纳米炭黑颗粒能引发体内外系统中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的产生[3,4]。采用经鼻吸入或者气管滴注方式暴露于纳米炭黑颗粒均可导致啮齿动物肺部发生炎症反应[5]，在小鼠肺部可观察到剂量依赖性或时间依赖性的炎细胞浸润，加剧ROS的形成[6]。与此同时，近年来越来越多的研究发现，低温刺激和冷空气活动可使呼吸系统疾病，如上呼吸道感染、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)、慢性支气管炎、肺炎、哮喘等的发病风险明显增加[7]。鉴于我国近几年冬季雾霾天气尤为严重，机体面临超细颗粒物及寒冷暴露的双重负荷刺激，本研究在Husain等[8]人的研究基础上，选择0.45 mg/ml及4.05 mg/ml纳米炭黑颗粒悬液作为染毒浓度，4 ℃作为动物实验冷暴露温度，拟通过建立纳米炭黑颗粒复合寒冷暴露动物模型，探讨二者协同对机体氧化应激水平的影响，为寒冷环境下纳米级炭黑颗粒危害性评价提供毒理学实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，BCA蛋白质定量试剂盒购自武汉博士德生物有限公司，纳米炭黑颗粒购自北京德科岛金科技有限公司，AJY220电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，CNL-24多样品组织研磨机(天津市科莱恩实验仪器有限责任公司)，TGL-6台式高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，酶标仪(瑞士Tecan公司)。

纳米炭黑颗粒染毒液的制备：用生理盐水缓慢冲洗正常小鼠肺部,采集到的肺泡灌洗液于4 ℃、1 500 r/min离心15 min，取上清配制含10%无细胞肺泡灌洗液的生理盐水液，用作纳米炭黑颗粒的分散液。准确称取18 mg纳米炭黑颗粒，加入4 ml配制好的分散液后密封，置漩涡振荡混匀器上初步振荡混匀，再超声振荡2 h，配制成4.05 mg/ml的高剂量纳米炭黑颗粒染毒液，稀释9倍制成0.45 mg/ml低剂量染毒液。

1.2 实验动物分组和染毒方法

72只健康SPF级雄性C57BL/6小鼠，体重(18±2) g，由军事医学科学院实验动物中心提供。动物饲养温度为(20±2)℃，相对湿度(50±10)%，自然光照，普通饲料喂养。实验期间小鼠可自由进食饮水。适应一周后，将实验动物随机分为6组：对照(Ctrl)组、冷暴露(C)组、低剂量染毒(L)组、低剂量染毒复合冷暴露(LC)组、高剂量染毒(H)组、高剂量染毒复合冷暴露(HC)组，每组12只。采用吸入式气管滴注方式进行一次性染毒。Ctrl和C组小鼠各滴注含纳米炭黑颗粒分散液40 μl，L和LC组小鼠各滴入浓度为0.45 mg/ml的染毒液40 μl，H和HC组小鼠各滴入浓度为4.05 mg/ml的染毒液40 μl。将所有冷暴露处理组小鼠两只一笼置于4 ℃进行4 h/d的冷暴露处理，共20 d。冷暴露期间所有小鼠禁食禁水。定期称取小鼠体重并记录。

1.3 小鼠肺重量及其脏器指数的测定

冷暴露结束24 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠。小鼠称重后，打开胸腔取出全肺，用冷生理盐水漂洗干净，滤纸吸干后称全肺湿重，以全肺湿重占小鼠体重之比计算小鼠肺脏器指数。

1.4 小鼠肺氧化应激指标的测定

取肺组织，按1：9 (g/ml)比例加入PBS制成10%的组织匀浆，以3 500 r/min离心20 min，取上清分装于离心管中，置-20 ℃冰箱中保存备用。采用相关试剂盒测定SOD活力、GSH-Px活力和MDA含量。

1.5 小鼠肺组织学观察

取3只小鼠肺组织，经4%多聚甲醛液固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、HE染色、脱水透明。制片后于光镜下观察组织病理改变。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 纳米炭黑颗粒表征

在透射电镜下对纳米炭黑颗粒进行表征，结果见图1。TEM检测结果表明：炭黑颗粒大体呈葡萄球状，分散性较好，颗粒直径为30～50 nm。

2.2 小鼠体重变化

在动物建模过程中，各组小鼠行为活动无异常，饲料和水的消耗量无明显差异。小鼠体重变化情况(表1)表明：单纯冷暴露组与纳米炭黑颗粒染毒复合冷暴露组的小鼠体重均显著低于对照组(P<0.05)，单纯冷暴露组和纳米炭黑颗粒染毒复合寒冷双重暴露组小鼠体重均显著低于单纯染毒组(P<0.05)，但低剂量染毒复合冷暴露和高剂量染毒复合冷暴露组之间无显著差异；对照组和单纯染毒组小鼠体重在染毒14 d后显著升高(P<0.05)，单纯冷暴露组与纳米炭黑颗粒染毒复合冷暴露组小鼠体重在冷暴露开始后显著减少(P<0.05)，在染毒14 d后小鼠体重均无显著变化。两因素方差分析显示，冷暴露对小鼠体重变化产生主效应，纳米炭黑颗粒物染毒与冷暴露复合对小鼠体重变化无交互作用。

Fig.1Characterization of Nanoscale Carbon Black Particles by TEM

Tab. 1 Effects of Nano-carbon black particles combined with cold exposure on the body weight of n=10)

Ctrl: Control group; C: Cold exposure group; L: Low dose group; LC: Low dose combined with cold exposure group; H: High dose group; HC: High dose combined with cold exposure group

*P<0.05，**P<0.01vsCtrl at the same day；#P<0.05vsthe same group on 0 day；△P<0.05，△△P<0.01vsL group at the same day;▲P<0.05，▲▲P<0.01vsH group at the same day

2.3 小鼠肺脏器指数的变化

纳米炭黑颗粒染毒复合冷暴露组小鼠肺组织重量及肺指数的变化见表2。与对照组相比，各组肺组织重量及其肺指数均无显著差异(P>0.05)。

2.4 肺组织病理学改变

纳米炭黑颗粒染毒复合冷暴露组小鼠肺部组织病理学改变见图2。由图2可见，对照组与单纯冷暴露组小鼠肺泡壁均显示增厚并有轻微充血现象(图2A、2B)；单纯染毒组及复合冷暴露的染毒组，肺支气管腔和肺泡腔内均可见散在的黑色颗粒沉积(图2C、2D、2E、2F)；高剂量染毒组可见肺泡壁明显增厚，血管内有充血现象，部分区域发生实变(图2E)；高剂量染毒复合冷暴露组可见肺泡结构破环，排列比较凌乱，有大量的炎细胞浸润，血管内充血明显(图2F)。

GroupMass of lung(g)Index of lung(%)Ctrl0.13±0.020.72±0.07 C0.13±0.010.73±0.08L0.13±0.010.71±0.04LC0.13±0.010.73±0.06H0.13±0.020.67±0.04HC0.13±0.020.70±0.06

Ctrl: Control group; C: Cold exposure group; L: Low dose group; LC: Low dose combined with cold exposure group; H: High dose group; HC: High dose combined with cold exposure group

Fig.2Morphological characteristics of lung by H&E staining(HE×200)

A: Control group; B: Cold exposure group; C: Low dose group; D: Low dose combined with cold exposure group; E: High dose group; F: High dose combined with cold exposure group

2.5 小鼠肺部氧化应激指标水平

纳米炭黑颗粒染毒复合冷暴露处理小鼠肺部氧化应激指标的变化(表3)表明：单纯冷暴露组、单纯染毒组及染毒复合冷暴露组的SOD活力均显著低于对照组(P<0.05)；染毒复合冷暴露组的T-SOD活力有低于单纯染毒组的趋势，差异无显著性(P>0.05)；单纯低剂量染毒和单纯高剂量染毒组间差异不显著(P<0.05)。单纯高剂量染毒组及高剂量染毒复合冷暴露组GSH-Px活力显著低于对照组(P<0.01)，且高剂量染毒组GSH-Px活力显著低于低剂量染毒组(P<0.01)；高剂量染毒复合冷暴露组GSH-Px活力显著低于低剂量染毒复合冷暴露组(P<0.05)；单纯染毒组与复合冷暴露的染毒组之间均无明显差异(P<0.05)。高剂量染毒组及染毒复合冷暴露组的MDA含量显著高于对照组(P<0.01)；炭黑颗粒染毒复合冷暴露组MDA含量显著高于单纯冷暴露组(P<0.05)，有稍高于单纯染毒组的趋势，差异无显著性(P<0.05)；单纯染毒组之间及染毒复合冷暴露组之间差异不显著(P<0.05)。两因素方差分析显示，冷暴露后肺组织SOD活力显著降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)；随着染毒剂量的增加，GSH-Px活力逐渐降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)；冷暴露与纳米炭黑颗粒物对SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影响无交互作用。

GroupSOD(U/mg Pro)GSH-Px(U/mg Pro)MDA(nmol/mg Pro)Ctrl70.53±9.371670.29±278.491.83±0.33C56.98±14.28*1551.48±188.042.26±0.60L57.93±8.05*1561.62±273.932.44±0.69LC51.99±9.26*1499.91±191.582.99±0.99*▲ H56.65±6.15*1273.26±228.64**##2.67±0.46**HC50.57±4.51*1206.39±157.51**△3.28±0.69**▲▲

Ctrl: Control group; C: Cold exposure group; L: Low dose group; LC: Low dose combined with cold exposure group; H: High dose group; HC: High dose combined with cold exposure group

*P<0.05，**P<0.01vsCtrl group;##P<0.01vsL group;△P<0.05vsLC group;▲P<0.05，▲▲P<0.01vsC group

3 讨论

近年来，我国发生灰霾天气的地区和次数呈突发上升趋势，给人们的生产、生活和健康带来巨大的危害，而超细颗粒物(UFPs)是灰霾的主要组成成分之一。超细颗粒物又称纳米颗粒物。UFPs的自然来源主要为生物燃烧，包括可控和不可控的森林火灾、草原火灾等；人为污染主要包括化石燃料的燃烧及汽车尾气的排放等。由于纳米颗粒具有小尺寸效应和高反应性，纳米颗粒可以不经过复杂的转运过程而直接穿透组织屏障或细胞膜进入细胞内部，甚至细胞器中，引起细胞调亡、DNA损伤、炎症反应等[9,10]，从而增加颗粒物的潜在毒性，与大直径颗粒相比具有更大的健康危害效应[11]。研究发现，呼吸系统是纳米级炭黑颗粒暴露最直接的作用靶点，当颗粒物进入肺组织后，颗粒物粒径的大小可以影响其在肺内的沉积部位，相对于微米级颗粒，纳米级炭黑颗粒毒性更强，更容易引起炎症反应[12]。而且纳米颗粒引起的活性氧簇(ROS)的生成量与其对肺部的促炎症效应有直接关系，过量ROS的产生可直接或间接诱导脂类、蛋白质及DNA分子结构和功能改变，导致组织损伤[13]。研究发现，低温刺激或冷空气活动可以改变生物体的氧化与抗氧化间的平衡，通过黄嘌呤氧化酶活性增高、髓过氧化物酶活性降低使机体产生过多的自由基，进而导致脂质过氧化作用增强，诱发氧化损伤[14]。由此可见，纳米颗粒及低温刺激均会对机体造成不良影响。因此，本研究结合冬季雾霾天气尤为严重的这一现状，通过对小鼠进行不同剂量纳米炭黑颗粒染毒与寒冷暴露的复合刺激，探讨4 ℃刺激下纳米炭黑颗粒染毒所致肺组织的氧化损伤情况。

研究结果表明，单纯冷暴露组和染毒复合冷暴露组小鼠体重均明显降低，炭黑颗粒染毒复合冷暴露组体重均显著低于单纯的染毒组，说明冷暴露及纳米炭黑颗粒物对小鼠的整体能量代谢均产生了不同程度的影响，且冷暴露与纳米炭黑颗粒的双重暴露对小鼠整体能量代谢的影响更加严重。

小鼠肺部病理检测显示，单纯染毒组及染毒复合冷暴露组小鼠肺泡腔内有黑色颗粒沉积；随着染毒物浓度的增加，支气管腔、肺泡腔内可见较多黑色颗粒沉积，肺组织纤毛破坏、肺泡壁结构紊乱、肺间隔增厚等变化更加明显。在染毒低、高浓度组均可见程度不一的充血、炎细胞浸润等病理改变，复合冷暴露后肺泡腔内出血更加严重。这表明纳米炭黑颗粒复合冷暴露对肺组织的破坏更严重。

在生理状态下，ROS作为中间体产生，受到各种解毒酶(如SOD、GSH-Px、CAT)及各种抗氧化剂(如维生素E和谷胱甘肽)的影响，这些抗氧化酶和抗氧化剂在机体清除自由基、防止各种病理变化的发生发展中发挥着重要作用[15]。研究表明，机体受到氧化损伤时，可导致过氧化产物增多进而使组织内SOD含量降低[16]。龙杰等发现，氧化应激使机体SOD活力显著下降，MDA含量显著升高[17]；罗斌等发现，低温刺激可引起机体SOD活力显著下降[18]。本实验中，单纯冷暴露组、单纯染毒组及纳米炭黑颗粒染毒复合冷暴露组小鼠肺部的SOD活性明显低于对照组；GSH-PX特异催化GSH对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用[19]，本实验中，高剂量染毒组及高剂量染毒复合冷暴露组的GSH-Px活力显著低于对照组，随着染毒剂量的增加GSH-Px活力降低。这表明冷刺激及纳米炭黑颗粒染毒均破坏了机体氧化与抗氧化之间的平衡，从而受到超氧离子自由基和过氧化氢的攻击，造成细胞损伤。丙二醛(MDA) 是体内脂质过氧化反应的最终产物，其含量高低可直接反映机体脂质过氧化的水平、速率和细胞受自由基攻击损伤的程度等，间接地反映细胞损伤的程度[20]。本实验中高剂量染毒组，高、低剂量染毒复合冷暴露组MDA含量显著高于对照组，表明高剂量纳米颗粒染毒及高剂量纳米颗粒染毒复合冷暴露使机体产生了大量的氧自由基，但未能及时清除，从而发生了脂质过氧化反应，导致机体组织器官受到损害。这与高剂量染毒组、高剂量染毒复合冷暴露组小鼠SOD和GSH-Px活力显著降低结果相呼应。

综上表明，纳米炭黑颗粒染毒复合冷暴露可导致小鼠肺部出现不同程度的氧化应激损伤，暴露状况不同对机体抗氧化防御系统的破坏程度亦不同，但纳米炭黑颗粒染毒复合冷暴露导致小鼠肺毒性的具体作用机制有待进一步深入研究。目前已有大量文献报道大气颗粒物对人体健康效应的影响，但将纳米颗粒物染毒与寒冷暴露结合起来，探讨复合因素对肺组织氧化损伤的影响尚未见报道。本研究着眼于纳米炭黑颗粒染毒与寒冷暴露对机体的共同作用，对两者之间内在联系进行的初步分析表明，纳米炭黑颗粒复合寒冷暴露可导致小鼠肺部炎症反应加重，氧化应激水平升高，寒冷与纳米炭黑颗粒之间无交互作用，这一结果可为冬季雾霾天气对健康的危害性提供毒理学基础。