王江 杨琳红 魏晓丽

【摘要】 目的：探讨Caspase-7蛋白在中耳胆脂瘤的发生、发展中的作用，为中耳胆脂瘤的临床诊断、治疗及预后提供新途径。方法：收集2016年12月-2017年7月佳木斯大学附属第一医院耳鼻咽喉科经病理科证实的术中标本45例。其中中耳胆脂瘤标本30例为试验组，正常外耳道皮肤组织15例为对照组。采用免疫组化SP法分别检测两组中Caspase-7蛋白的表达情况。结果：Caspase-7蛋白在试验组的阳性表达要明显高于对照组，差异有统计学意义（字2=4.727，P<0.05）。结论：在中耳胆脂瘤上皮组织中Caspase-7蛋白呈高表达趋势，其阳性表达率显著高于正常外耳道皮肤组织，提示Caspase-7蛋白在中耳胆脂瘤的发生发展中起到重要作用。

【关键词】 Caspase-7； 中耳胆脂瘤； 增殖； 凋亡； 免疫组织化学

【Abstract】 Objective：To explore the roles of Caspase-7 in the progression and development of cholesteatoma of middle ear，then to provide a new approach for the clinical diagnosis，treatment and prognosis of this disease.Method：A total of of 30 epithelial tissues of cholesteatoma of middle ear（the experimental group）and 15 normal epithelial tissues of external auditory canal（the control group）were collected from otolaryngological department of the First Affiliated Hospital of Jiamusi University from December 2016 and July 2017.SP approach of immunohistochemistry was used to examine the expression of two groups.Result：The positive expression rate of Caspase-7 in the experimental group was higher than that in the control group，the difference was statistically significant（字2=4.727，P<0.05）.Conclusion：Caspase-7 is showed high expression trend in epithelial tissues of cholesteatoma of middle ear.And the positive expression rate is significantly higher than the normal epithelial tissues of external auditory canal，suggesting that Caspase-7 plays an important role in the occurrences and developments of the cholesteatoma of middle ear.

【Key words】 Caspase-7； Cholesteatoma of middle ear； Proliferation； Apoptosis；

Immunohistochemistry

First-authors address：Jiamusi University，Jiamusi 154007，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.15.021

中耳膽脂瘤是耳科的一种常见疾病，也是一种来自在颞骨鳞状上皮角化异常形成的边界清楚的良性囊性病变[1-2]。中耳胆脂瘤虽是良性病变，却具有类似于肿瘤的特性：持续增殖性生长、破坏周围骨质以及向周围侵袭的能力。鳞状上皮在慢性感染的情况下逐渐被破坏，再加上胆脂瘤基质酶活性的增加，提高了胆脂瘤的溶骨作用[3]。对于没有及时治疗的患者尤其是小儿患者，存在颅内并发症甚至引起死亡的风险[4]。虽然人们对中耳胆脂瘤做了大量的研究，但是发病机制目前仍然不完全清楚。根据以往的研究提示凋亡途径可能是其中一个重要因素。

Caspase-7 Cysteine aspartate specific protease 7（Caspase-7）是Caspase蛋白家族的重要成员，承担着凋亡执行的重要任务，是凋亡通路中必不可少的因子之一。研究表明Caspase-7参与了多种组织中的凋亡过程[5]，在多种癌症的发生发展中起到重要作用。目前国内外尚无对Caspase-7蛋白在中耳胆脂瘤中研究的报道。本次研究采用兔抗人CASP7多克隆抗体，应用免疫组化SP法，检测Caspase-7蛋白在30例中耳胆脂瘤上皮组织和15例正常外耳道皮肤组织中的表达情况，并运用统计软件分析Caspase-7蛋白在中耳胆脂瘤组织中的表达情况，揭示Caspase-7蛋白在中耳胆脂瘤的发生、发展中的作用，并深入探讨中耳胆脂瘤与细胞凋亡之间的关系，为中耳胆脂瘤的临床诊断、治疗及预后提供新途径，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2016年12月-2017年7月佳木斯大学附属第一医院耳鼻咽喉科经病理科证实的术中标本45例。其中中耳胆脂瘤标本30例为试验组，正常外耳道皮肤组织15例为对照组。男20例，女25例，年龄3～74岁，平均48.4岁。所有标本均来自乳突根治术及中耳探查术患者，术后2 h内将标本经10%的中性福尔马林溶液固定，24 h后将浸润在10%福尔马林溶液的标本用石蜡固定包埋、冷冻，放置4 ℃恒温冰箱中冷藏待用，实验时将包埋石蜡切片每例连续切片3张，最后通过苏木精-伊红染色，并阅读切片、记录。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 兔抗人CASP7多克隆抗体购买于生工生物工程（上海）股份有限公司。PV-8000-1二步法通用试剂盒（6 mL），ZLI-9018 DAB显色试剂盒（3 mL），ZLI-9029抗体稀释液（50 mL），ZLI-9062 PBS缓冲液粉末（pH 7.3）10袋/包，均购于北京中衫金桥生物技术有限公司。梯度酒精、蒸馏水、二甲苯、中性树胶及苏木精、过氧化物酶阻断剂，免疫动物血清、SP免疫组化试剂盒、生物素标记的第二抗体、PBS枸橼酸抗原修复缓冲液均由佳木斯大学附属第一医院病理科提供。

1.2.2 免疫组化 利用免疫组化（SP）四步法检测中耳胆脂瘤组织与正常外耳道皮肤组织中Caspase-7与Bak蛋白的表达情况。将一抗兔抗人CASP7多克隆抗体按照1︰200的浓度进行稀释，同时利用PBS枸橼酸抗原修复缓冲液对标本组织进行酸修复，以PBS代替一抗做阴性对照。利用HE染色后用中性树胶封片，显微镜下观察。

1.3 观察指标与评价标准 所有切片全部采用双盲法进行观察与计数（以病理科两位正高职称医师为准），避开组织切片的边缘，选择明显强于背景着色处计数。每张病理切片至少在高倍镜（SP×200）下观察10个以上不重复的视野，继而判断细胞染色强度和细胞染色百分比率，并按照相关标准计分[6]。按照染色强度计分：未着色为0分；淡染者1分；中等染色为2分；强染色为3分。染色范围按阳性细胞数所占百分数计分：无阳性细胞为0分，≤10%为1分，10%～25%为2分，25%～50%为3分，50%～75%为4分，>75%为5分。两项得分结果相加后分为四级：0分（-）；1～2分（+）；3～4分（++）；5～6分（+++）。其中“-“为阴性表达，”+“为阳性表达。

1.4 统计学处理 应用SPSS 16.0软件包对所得的实验数据进行相关的统计学分析，本次研究中计数资料采用字2检验、而组间相关分析采用Spearman等级相关分析法。检验水准α=0.05。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

通过阅片发现，Caspase-7蛋白主要定位于胞浆中，其阳性信号为胞浆内黄色、棕黄色以及棕色颗粒状物。通过比较发现，Caspase-7蛋白几乎聚集在中耳胆脂瘤上皮的全层，较为密集，见图1；而在正常外耳道皮肤组织中表达稀疏，强度较弱，见图2。通过统计发现，试验组阳性表达22例，阳性率为73.3%（22/30），其中强阳性（+++及以上）表达12例，强阳性率为40.0%（12/30）；而对照组中仅有6例阳性表达，阳性率为40.0%（6/15），且胞浆中阳性信号较为稀疏，无强阳性表达。通过统计学分析，Caspase-7蛋白在试验组的阳性表达要明显高于对照组，差异有统计学意义（字2=4.727，P<0.05），见表1。

3 讨论

中耳胆脂瘤是一种来自在颞骨鳞状上皮角化异常形成的邊界清楚的良性囊性病变[1-2]，其局部侵袭性生长可导致局部正常中耳结构被破坏[3]。鳞状上皮在慢性感染的情况下逐渐被破坏，再加上胆脂瘤基质酶活性的增加，提高了胆脂瘤的溶骨作用[3]。由胆脂瘤进步骨侵蚀可导致永久性耳聋，前庭功能障碍，面瘫，更致命的颅内并发症[7]。

前体Caspase-7是由储存在细胞质中的待组装的303个氨基酸组成的同源二聚体[8]。这些同源二聚体是由位于中央的12股β片状折叠及周围的10股α螺旋组成的[9-10]。这种所谓的“开放α/β桶折叠”包括两个相同的反平行排列的酶单位，每个单位各携带一个特殊的活性位点，每一个酶单位都是由一大一小两个催化亚基（大小分别为20 kDa和11 kDa）组成，它们在Caspase-7酶原的接头序列相互连接，而这种连接正好阻碍了活性位点的激活[11]。通过分别裂解Asp 198和Ser 199以及Ser 199和Ala 207之间的肽键来实现连接区域的断裂，从而使得环形结构L2、L3和L4进行空间重组并形成活性位点和底物结合口袋[11]。活化后的Caspase-7会进一步诱导细胞凋亡。

大多数的研究表明Caspase-7在多种组织中参与了细胞凋亡的发生发展[5]，并与多种肿瘤的发生发展密切相关。Matalova等[12]在人第一磨牙原发性釉结（发生细胞凋亡的部位）检测出活化的Caspase-7蛋白，同时在分化的成齿质细胞和釉母细胞中的非凋亡区域也检测出Caspase-7蛋白。进一步的研究发现敲除小鼠Caspase-7基因后小鼠切牙釉质沉积量显著减少[13]。Chaudhary等[14]通过研究发现Caspase-7在乳腺癌组织中的表达率显著高于正常组织，并证实其是乳腺癌发生的重要因素之一。还有学者研究发现Caspase-7与中、高分化的口腔鳞状细胞癌的发生密切相关[15]。下调或抑制Caspase-7蛋白的表达会不同程度地降低肿瘤细胞的增殖[16-17]。这些研究均提示Caspase-7蛋白在肿瘤组织的发生发展中发挥重要作用。

根据大量研究可将中耳胆脂瘤的发病机制分为五类：（1）内陷囊袋理论（缩回口袋理论）；（2）上皮侵袭或迁移理论（移植理论）；（3）鳞状化生学说；（4）基底细胞增生（乳头状生长理论理论）；（5）黏膜牵引理论[18-19]。但是无论哪种学说都无法完美的解释胆脂瘤的发病原因。目前学者们普遍认为在中耳胆脂瘤中凋亡水平和增殖水平都要显著高于正常皮肤，这一结论早在20世纪90年代后期已由Kojima等[20]和Ergün等[21]证实。在此结论后的研究中不断发现新的凋亡因子以及增殖通路在中耳胆脂瘤组织中高表达，这也表明了在中耳胆脂瘤组织中凋亡水平与增殖水平达到了一个“相对平衡”的状态，阻碍了中耳胆脂瘤向恶性的方向发展。一方面中耳胆脂瘤组织增殖水平的提高，加快了胆脂瘤上皮细胞的分化与增殖，使胆脂瘤不断生长并破坏周围临近正常组织。另一方面由于机体的“自我保护”机制的开启，使得中耳胆脂瘤组织中众多的凋亡因子被激活，从而激发了内源性及外源性凋亡通路的发生，使得过度增殖的胆脂瘤上皮发生凋亡，其结果就是大量“鳞屑样物”的堆积，这也进一步促使了中耳胆脂瘤的生长。

Caspase蛋白家族是凋亡通路中不可或缺的因子，几乎贯穿着凋亡通路的全过程。Caspase-7蛋白是Caspase蛋白家族中重要的效应因子，在凋亡通路的执行阶段中起到决定性作用。在本研究中，通过免疫组化SP法处理了30例中耳胆脂瘤上皮组织与15例正常外耳道皮肤组织标本，发现在中耳胆脂瘤上皮组织标本中阳性表达率为73.3%（22/30），阳性信号几乎覆盖上皮全层，表达较为密集。而在15例正常外耳道皮肤组织中，阳性表达率仅为40%。通过此研究发现Caspase-7蛋白在中耳胆脂瘤上皮中的阳性表达率要高于正常外耳道皮肤组织（字2=4.727，P<0.05）。这一研究结果表明了Caspase-7蛋白在中耳胆脂瘤的发生发展过程中发挥了重要作用。同时也表明了中耳胆脂瘤上皮中的凋亡水平比正常组织要显著提高，提示凋亡水平的提高也是胆脂瘤发生发展的一个不可或缺的因素，也让我们对胆脂瘤的发病机制有了更深入的认识。

综上所述，在中耳胆脂瘤上皮组织中Caspase-7蛋白呈高表达趋势，其阳性表达率显著高于正常外耳道皮肤组织，提示Caspase-7蛋白在中耳胆脂瘤的发生发展中起到重要作用。

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