陈建福，曾勤，2，吴丽敏，曾小芳，

（1.漳州职业技术学院食品工程学院，福建漳州363000；2.福建省精细化工应用技术协同创新中心，福建漳州363000；3.闽南师范大学生物科学与技术学院，福建漳州363000）

柚是芸香科常绿乔木植物，分布于我国广东、福建、浙江、湖南和广西等14个省区[1]。柚子营养丰富，全身是宝，其果实除可以鲜食或加工外，其果皮、树叶、树根等都含有一定量的精油、黄酮和多酚等多种天然活性物质[2-3]。柚叶本身苦涩，无法直接食用，因此更要注重深加工等综合利用，柚叶中含有黄酮类物质，是一种理想的黄酮类物质的原材料[4]。黄酮是广泛存在植物中的一种天然活性成分，具有抗菌、扩张血管、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗癌等多种生理功效，引起人们的广泛关注[5-6]。另外，植物中有效成分会因植物的品种、产地等不同而具有不同的产量，为充分利用漳州琯溪蜜柚叶资源，开发出新的柚叶深加工产品，本文以漳州产琯溪蜜柚叶为材料，利用超声波对柚叶总黄酮进行提取，并在超声波提取的基础上，继续使用纤维素酶对柚叶进行预处理，并用响应面优化酶预处理的工艺条件，为柚叶总黄酮的提取与应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柚叶：采于漳州市平和县的琯溪蜜柚；纤维素酶（食品级，1万U/g）：天津市诺奥科技发展有限公司；芦丁（标准品）：上海沪宇生物试剂公司；其它试剂均为分析纯。

UV-1100型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；KQ-100DE超声波：江苏省昆山市淀山湖镇；HH-2数显恒温水浴锅：金坛市科析仪器有限公司；EL-20实验室pH计：梅特勒-托利多上海有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 总黄酮标准曲线的绘制

取芦丁标准品0.100 0 g，用70%乙醇溶解，置于100 mL的容量瓶中，定容至刻度线，配成1.0 g/L的标准溶液。取5 mL置于50 mL的容量瓶中，定容至刻度线，配成0.1 g/L的芦丁母液。分别从中取0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 的溶液置于试管中，再依次添加浓度为70%的乙醇至5.0 mL，此时溶液的浓度分别为0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L。依次加入0.3 mL 5%的NaNO2，摇匀后静置5 min，加入0.3 mL

式中：b为总黄酮质量浓度，mg/L；V为提取液体积，L；m 为柚叶的质量，g。

1.2.3 超声波辅助提取方法

将采摘的琯溪蜜柚叶浸泡于蒸馏水，洗净，自然晾干，并于50℃的鼓风干燥箱中干燥，粉碎，取60目～80目之间的粉末，备用。称取一定量的柚叶粉末装入100 mL的圆底烧瓶中，置于超声波清洗器中进行提取，提取结束后，按1.2.1和1.2.2计算得总黄酮提取率。利用响应面对该工艺进行优化，得到了最佳工艺条件。

1.2.4 纤维素辅助提取柚叶多酚

利用纤维素酶对柚叶进行预处理，预处理完后，在最佳的超声工艺条件下，对柚叶总黄酮进行提取，并计算得到柚叶总黄酮的提取率。

1.2.4.1 酶解温度对总黄酮提取率的影响

固定酶解时间60 min、酶用量3%、pH 5.6的条件下，考察不同酶解温度（45、50、55、60、65 ℃）对总黄酮提取率的影响。

1.2.4.2 酶解时间对总黄酮提取率的影响

固定酶解温度55℃、酶用量3%、pH 5.6的条件下，考察不同酶解时间（20、40、60、80、100 min）对总黄酮提取率的影响。

1.2.4.3 酶用量对总黄酮提取率的影响

固定酶解温度55℃、酶解时间60 min、pH 5.6的条件下，考察不同酶用量（1%、2%、3%、4%、5%）对总黄酮提取率的影响。

1.2.4.4 pH值对总黄酮提取率的影响

固定酶解温度55℃、酶解时间60 min、酶用量3%10%的Al（NO3）3，摇匀静置6 min，再依次添加2 mL 4%的NaOH，摇匀，继续添加70%的乙醇至10 mL，静置15 min。置于510 nm吸光度下进行比色，测定吸光度并进行线性拟合得到回归方程y=7.614 2x+0.000 3，R2=0.999 8。

1.2.2 柚叶总黄酮的测定

按上述回归方程测定提取所得的柚叶提取液，计算出柚叶总黄酮的提取率。的条件下，考察不同 pH（4.8、5.2、5.6、6.0、6.4）对总黄酮提取率的影响。

1.3 响应面的因素与水平设计

依据单因素试验结果和Box-Behnken试验设计原理，对影响柚叶黄酮提取率的酶解温度（A）、酶解时间（B）、酶用量（C）和 pH（D）4个变化因素进行设计。表1为响应面设计因素编码及水平表。

表1 因素与水平表Table 1 Table of Factors and levels

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 酶解温度对黄酮提取率的影响

酶解温度对黄酮提取率的影响见图1。

图1 酶解温度对黄酮提取率的影响Fig.1 Effects of hydrolysis temperature on yield of total flavonoids

由图1可以看出，酶解温度在45℃～55℃范围内，总黄酮的提取率逐渐上升，当酶解温度达到55℃时，总黄酮的提取率达到最大，酶解温度继续升高到55℃～65℃，总黄酮提取率逐渐下降。这是因为随着酶解温度的升高，酶的活性越高，对原料作用越充分，提取率提高；而酶有一个最适作用温度，当温度过高时，酶的活性会降低，从而使得总黄酮提取率降低[7]。因此酶解温度选择为55℃。

2.1.2 酶解时间对黄酮提取率的影响

酶解时间对黄酮提取率的影响见图2。

由图2可以看出，酶解时间在20 min～60 min范围内，总黄酮的提取率逐渐上升，当酶解时间达到60 min时，总黄酮的提取率达到最大，酶解时间继续延长到在60 min～100 min时，总黄酮提取率又开始下降。这是因为酶解时间较短时，酶与柚叶作用还没有完全，酶活力得不到体现，总黄酮提取率较低，随着酶解时间的延长，总黄酮提取率提高，但过长的酶解时间，总黄酮提取率无法再提高，甚至出现了下降[8]，最佳的酶解时间选择为60 min。

2.1.3 酶用量对黄酮提取率的影响

酶用量对黄酮提取率的影响见图3。

图2 酶解时间对黄酮提取率的影响Fig.2 Effects of hydrolysis time on yield of total flavonoids

图3 酶用量对黄酮提取率的影响Fig.3 Effects of cellulase dosage on yield of total flavonoids

由图3可以看出，酶用量在1%～3%范围内，总黄酮的提取率逐渐上升，当酶浓度达到3%时，总黄酮的提取率达到最大，继续增加酶浓度到3%～5%时，总黄酮提取率又开始下降。这是因为随着纤维素酶用量的增加，纤维酶与更多的柚叶细胞壁作用，促进了柚叶颗粒内黄酮的溶出，提高总黄酮提取率；而当纤维素酶用量过大时，酶与底物的作用达到饱和，酶解作用受到抑制，降低了黄酮的提取率[9]，最佳的酶用量选择为3%。

2.1.4 pH值对黄酮提取率的影响

pH值对黄酮提取率的影响见图4。

由图4中可以看出，pH值在4.8～5.6范围内，总黄酮的提取率逐渐上升，当pH值达到5.6时，总黄酮的提取率达到最大，继续增加pH值到5.6～6.4时，总黄酮提取率又开始下降。这是因为酶是一种蛋白质，有适宜的pH范围，在柚叶总黄酮提取过程中纤维素酶在pH值为5.6时为最适宜，过高或过低的pH值，酶的活性都会降低[10]，最佳的pH值选择为5.6。

图4 pH值对黄酮提取率的影响Fig.4 Effects of pH on yield of total flavonoids

2.2 响应面优化试验结果与分析

2.2.1 响应面试验

用Design-Expert 8.0b软件对试验数据进行回归分析。利用其中Box-Behnken试验的四因素三水平试验共29个试验点，其中24个为析因试验，5个为中心点试验。自变量取值在A，B，C，D所构成的三维顶点；后5个为区域的中心点，用来估计试验误差。柚叶黄酮提取率见表2。

表2 Box-Behnken试验结果Table 2 The result of Box-Behnken experiment

续表2 Box-Behnken试验结果Continue table 2 The result of Box-Behnken experiment

表3 方差分析表Table 3 The variance analysis

对表2中的试验数据进行分析得响应值黄酮提取率（Y）与 酶解温度（A）、酶解时间（B）、酶用量（C）、pH值（D）4个因素的二次多项式回归模型为：

由回归方程的方差分析（见表3）可知，F=28.75，P<0.000 1达到了极显著水平，说明该回归方程能够正确反映柚叶总黄酮提取率与各工艺条件之间的关系。失拟项P=0.330 2>0.05，不显著，表明回归方程与试验值拟合较好，试验误差小。模型的相关系数R2为0.966 4，表明试验值与预测值之间有较好的拟合度，校正系数R2adj为0.932 8，表明有93.28%的总黄酮提取率变异分布与所研究的4个工艺因素相关。一次项A、B、D，二次项 A2、B2、C2、D2差异极显著；交互项 AD、CD差异显著，一次项C，交互项AB、AC、BC、BD差异不显著，说明柚叶总黄酮提取率与所考察的酶解温度、酶解时间、酶用量和pH值之间不是简单的线性关系。根据表中的F值及P值，可以看出影响因素的主次顺序为：酶解温度>酶解时间>pH值>酶用量。综述分析，说明采用响应面法设计与预测的回归模型具有较高的准确性和可靠性。

2.2.2 响应面分析

利用响应面及等高线可以直观地反映出酶解温度、酶解时间、酶用量和pH值各因素之间的交互作用关系，利用Desing-Expert 8.05b软件作出响应面图及等高线图如图5所示。

图5 各因素交互作用对总黄酮提取率的影响Fig.5 Effects of factors interactive on yield of total flavonoids

从图5中可以看出，随着各因素水平的升高或延长，柚叶总黄酮的提取率均出现先增加后减小的趋势，根据图中等高线图显示，等高线沿酶解温度轴向变化相对密集，沿酶解时间、pH值、酶用量轴向变化相对稀疏，再从响应面的陡峭程度，可以得出，酶解温度对柚叶总黄酮提取率的影响要大于酶解时间、pH值和酶用量。同理从图中可以得出酶解时间对柚叶总黄酮的提取率要大于pH值和酶用量，pH值对柚叶总黄酮提取率的影响要大于酶用量，验证了单因素及交互作用对柚叶总黄酮提取率的主次顺序。

2.2.3 验证试验

根据Design-expert 8.0b软件对所得的二次回归方程进行分析得到纤维素酶辅助提取柚叶总黄酮的最佳工艺为酶解温度56.13℃、酶解时间64.15 min、酶用量3.04%和pH 5.52，在此条件下，根据回归方程得到的柚叶总黄酮的提取率为38.79 mg/g。考虑实际的操作的局限性与便利性，将最佳提取工艺条件修正为酶解温度56℃，酶解时间64 min，酶用量3%和pH 5.5，在该条件下进行3次重复验证试验，测得柚叶总黄酮提取率为38.62 mg/g，与理论值（38.79 mg/g）相对误差为0.44%，说明该模型具有较高的准确性和可靠性，因此可以利用响应面法对柚叶总黄酮提取工艺进行优化。

3 结论

考察酶解温度、酶解时间、酶用量和pH值对柚叶总黄酮提取率的影响，利用Box-Behnken试验设计对酶解工艺中各影响因素进行响应面优化，建立了四元二次回归方程，并通过方差和响应面分析分析得到影响柚叶总黄酮提率的主次顺序为：酶解温度>酶解时间>pH值>酶用量。通过Box-Behnken组合设计和响应面优化得到最佳的工艺条件为酶解温度56℃，酶解时间64 min，酶用量3%，pH 5.5，在该条件下测得柚叶总黄酮提取率为38.62 mg/g，与理论值（38.79 mg/g）相对误差为0.44%，说明该模型具有较高的准确性和可靠性，可能利用该模型对柚叶总黄酮的提取工艺进行分析与预测。