曹 栎，赵小光，王竹云，张耀文，张文学，关周博，韩海斌

(陕西省杂交油菜研究中心，陕西 杨凌 712100)

油菜是我国食用植物油和饲用蛋白质的最主要来源之一，近年来菜籽油约占我国食用植物油消费量的40%，菜籽饼粕约占我国饼粕消费量的25%[1]，常年油菜种植面积和总产量一直位居世界第一，约占世界的1/3[2]。然而我国食用植物油自产不到1000万t，自给率约为38%，供需矛盾十分突出，从而导致食用植物油进口依赖率过高[3-4]。为了保证食用油的安全供应，国家把发展油菜生产作为农业工作中的重点，但是近年来我国油菜杂交种的产量一直未有大的突破[5]，在生产中各种提高油菜产量的途径都已发挥了作用，但产量提高幅度不是很明显，因此国内外众多的育种专家将目光投向“高光效生理育种”这种新型育种模式[6-8]，希望通过改良作物光能利用率，调节光合产物在各途径中的分配，从源头上改变产量停滞不前的局面。

叶片是植物进行光合作用和蒸腾作用的重要场所，也是制造养分的重要器官[9-10]，而叶面积是决定植物光合作用产物量的重要因素，叶面积的大小决定着光合有效辐射的大小，反映了植物对地理分布和养分条件等外界因素的适应策略[11-12]。同时，叶面积也是影响植物生长、果实发育和品质的重要生理和形态指标[13-15]，因此建立方便、准确的油菜叶面积测定方法有着极为重要的实用价值。目前测量叶面积的方法主要有方格计数法、画纸称重法、打孔法、叶面积仪器法、图像处理法和系数回归法等。由于不同植物叶片的形态差异较大，因此叶面积测定的适宜方法也不同，并且不同水平的实验对测量方法要求也不尽相同。已有学者在多种作物上对上述方法的测定效果进行了评价[16-19]，但关于甘蓝型油菜叶面积测定方法比较的研究尚未见报道。本文采用方格计数法、打孔法、叶面积仪器法和系数回归法对甘蓝型油菜的无柄叶、短柄叶和长柄叶这3种不同发育时期的功能叶片分别进行了叶面积测定，比较各方法之间的差异，寻求适合油菜叶面积测量的最佳方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘蓝型油菜(Brassicanapus)秦优7号由陕西省杂交油菜研究中心提供。实验于2016～2017年在陕西省杨凌示范区实验田进行，试验按随机排列，重复3次，4行区种植，每小区面积7.2 m2。分别在苗期采取油菜的最大长柄叶，在薹期采取油菜倒一短柄叶和第一无柄叶进行测定，每种油菜叶片随机采取15个单株进行测定，叶片无明显遮阴和病害。

1.2 试验方法

1.2.1 方格计数法 将油菜叶片置于0.5 cm×0.5 cm方格纸上，用铅笔沿边缘画出叶形，然后对轮廓内的方格进行计数。叶面积S=方格数×0.25[20]。

1.2.2 打孔法 对鲜叶片进行称重，计为W，然后用直径为1 cm的打孔器在每个叶片上均匀的选取5个点进行打孔，计算出单位重量叶面积A，叶面积S=W×A。

1.2.3 叶面积仪法 使用美国LI-COR公司的LI-3000C叶面积仪对每片叶片进行单独测量，并记录下各叶片的叶面积。

1.2.4 系数回归法 测定每个叶片的最大长度、最大宽度与叶片鲜重，通过方格计数法、打孔法和叶面积仪器法测得的叶面积求平均数后与叶长、叶宽、叶片长宽积、鲜叶重等参数进行回归分析[21]。

1.2.5 数据的整理与计算 数据利用Excel 2003软件进行初步整理，用SPSS 19.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同叶面积测定方法比较

通过方格计数法、打孔法、叶面积仪法分别对甘蓝型油菜的3种功能叶片进行了测定，并用SPSS 19.0对每种叶片的不同方法进行了差异显著性分析，结果如表1所示。可以看出，无柄叶、短柄叶和长柄叶通过3种方法测定的结果均无显著性差异。相关性分析表明，3种方法测定结果的相关系数都在0.99以上，说明这3种方法均可作为甘蓝型油菜不同发育时期功能叶片叶面积的精准测定方法。

表1 不同功能叶的叶面积测定方法比较

注：大、小写字母不同代表差异达到显著或极显著水平。下同。

2.2 不同功能叶的系数回归法分析

分别测定3种功能叶的叶长、叶宽、鲜叶重等参数，结果如表2所示。可以看出，除了无柄叶和短柄叶的长宽积不存在显著性差异，3种功能叶的其他参数均存在显著差异。无柄叶由于发育时间较短，营养物质积累较少，所以鲜叶重最低，而长柄叶不仅叶面积最大，而且发育时期较长，所以鲜叶重远大于无柄叶和长柄叶。无柄叶的长宽比为3.73，而短柄叶和长柄叶分别为1.21和1.04，说明无柄叶从外形上和其他2种功能叶差异较大，比较狭长。

表2 不同功能叶的叶片参数

将3种功能叶的每个叶片通过方格计数法、打孔法、叶面积仪法测得的叶面积值求平均值，然后与各自的叶长、叶宽、长宽积和鲜叶重等参数进行回归分析。从图1～图3可以看出，3种功能叶的叶面积与各自的叶长、叶宽、长宽积和鲜叶重均呈正相关。在回归曲线中，R2值越高，表明回归曲线上的估计值与实测数值之间的拟合度越高。在无柄叶中，各叶片参数与叶面积的拟合度大小依次为长宽积﹥叶长﹥叶宽﹥鲜叶重(图1)；在短柄叶中，各叶片参数与叶面积的拟合度大小依次为长宽积﹥鲜叶重﹥叶长﹥叶宽(图2)；在长柄叶中，各叶片参数的与叶面积的拟合度大小依次为长宽积﹥叶长﹥鲜叶重﹥叶宽(图3)。从上述结果可以看出，在4个叶片参数中，叶片的长宽积最能反映出叶面积的变化趋势，通过该回归曲线可以快速而准确地计算出甘蓝型油菜不同发育时间功能叶的叶面积。

3 结论

本研究首次在甘蓝型油菜上使用方格计数法、打孔法、叶面积仪法3种方法直接测定不同时期功能叶片的叶面积，并通过不同叶片参数与叶面积进行了回归分析，确定了各功能叶在系数回归法测定叶面积时的最佳叶片参数。通过分析可以看出，方格计数法、打孔法和叶面积仪法均能精确地测定出不同发育时期的叶片面积，且3种方法均无显著差异，结果比较可靠。然而方格计数法操作比较费时和复杂，不适宜在田间进行测定；打孔法需要将叶片采摘下来进行离体测定，常会对植株造成损伤，影响后续的实验，且打孔时需要尽量避开叶脉来减小实验误差；叶面积仪法对叶片性状有一定的限制，对于卷曲的叶片难以准确测定，且不方便长时间携带该仪器在田间进行操作。在育种工作中，常需要大量地测定作物的叶片面积，且大部分实验在田间开展，从而给以上3种方法的测定带来很大的困难。系数回归法很好地解决了育种上测定叶面积时“量”与“质”的问题，仅需简单测量多个叶片参数，通过回归曲线快速而准确的在大田条件下得到作物的叶面积，从而为育种工作提供大量的原始数据。

图1 无柄叶的叶面积与叶片参数的回归分析

图2 短柄叶的叶面积与叶片参数的回归分析

图3 长柄叶的叶面积与叶片参数的回归分析

王家保等[22]根据实验结果认为，在利用系数回归法测量叶面积时，不同的种树其应选择的叶片参数不尽相同。所以在通过系数回归法测量甘蓝型油菜叶面积时，不同功能叶选择叶片参数也不一定相同，这需要在试验前针对不同叶片建立回归模型，从而选择出最能反映其实际叶面积的叶片参数。Uzokwe等[23]的研究表明，叶片的长宽积是系数回归法测量叶面积的最佳叶片参数，这与本研究的结果相一致。在本实验中，无柄叶、短柄叶和长柄叶3种功能叶的最佳叶片参数均为叶片的长宽积，R2值都在0.95以上，与叶面积的拟合度较高。随着我国油菜产业的进一步发展，传统的育种模式逐渐与新技术结合，叶面积作为反映作物光合性能的一个重要指标，其测定方法将在高光效育种与生理研究中得到更为广泛的应用。