肖玉菲，陈博雯，覃子海，覃玉凤，晏 巢，刘海龙*

(1.广西壮族自治区林业科学研究院/广西优良用材林资源培育重点实验室，广西 南宁 530002；2.中国林业科学研究院 亚热带林业实验中心，江西 分宜 336600)

大百合(Cardiocrinumgiganteum)为百合科(Liliaceae )大百合属(Cardiocrinum)多年生草本植物[1]，我国大百合主要分布在云南、西藏、四川、陕西、湖北、河南等地，其中四川是我国大百合分布最密集的地方[2]，其鳞茎富含淀粉等10余种营养成分[3]，可作药食两用，具有较高的开发利用价值。

大百合种子繁殖所用周期较长，从萌发到形成商品球需3～4年[4]；鳞片扦插繁殖常携带病菌，难以在短时间内获得无菌苗；传统的分球繁殖，会导致鳞茎逐年变小而退化，繁殖速度缓慢，不能满足市场需求[5]。采用组织培养技术，既可以良好地保存百合的种质资源，有效地保证遗传的稳定性[6]，又可以使繁殖速度大大增加[7]，对于其大规模推广、应用具有重要意义。然而，我国对大百合这一珍贵野生植物资源的开发刚刚起步，目前对野生大百合的研究多集中于其资源概况[8]、营养成分[9]、栽培[10]、生物多样性[11]等方面，有关其组织培养技术的研究甚少[12-13]，且尚未形成规模化生产的技术体系。本文以大百合鳞茎作为试验材料，研究了培养基、激素配比、蔗糖浓度和光照强度对于鳞茎诱导出芽的影响，旨在为其组培快繁体系的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以大百合鳞茎作为供试材料，均采自湖南省邵阳市新宁县，保存于4 ℃冰箱中。试验前剪除大百合鳞茎根系，剥除最外层腐烂、褐化、带病斑的鳞茎，用自来水冲洗鳞茎间泥土，轻轻地将鳞茎逐层剥离，保留部分鳞茎盘。选择靠近鳞茎盘位置的中层鳞茎作为外植体，置于洗洁精溶液中浸泡5 min，其间不断擦洗、搅动，流水冲洗干净后用75%酒精消毒1 min，超纯水冲洗4～5遍，置于超净工作台上，再用0.1%升汞消毒8～12 min，无菌水冲洗4～5遍，将消毒后的外植体切成1.0～1.5 cm2大小，用消毒后的滤纸吸干浸出液和水分备用。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基筛选试验 分别选择MS、WPM、B5、N6、White和Nitsch作为基本培养基，并附加一定浓度的激素和蔗糖(6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+ZT 0.08 mg/L+蔗糖30 g/L)[12]进行试验对比，每瓶接种1个鳞茎块，每个处理接种30瓶，重复3次，培养8周后观察并记录鳞茎诱导情况。培养基pH值调为5.8～6.0，培养温度(25±2) ℃，日光灯光源，光照时间12～14 h/d，光照强度1500～2000 lx。

1.2.2 激素配比试验 选择MS作为基本培养基附加不同浓度的激素6-BA、NAA、IBA、KT和ZT，蔗糖浓度为30 g/L，具体处理见表1。每瓶接种1个鳞茎块，每个处理接种30瓶，重复3次，培养8周后观察并记录鳞茎诱导情况。培养基pH值调为5.8～6.0，培养温度(25±2) ℃，日光灯光源，光照时间12～14 h/d，光照强度1500～2000 lx。

1.2.3 蔗糖浓度试验 以MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+ZT 0.08 mg/L为培养基，蔗糖浓度设置15、30、45 g/L共3个处理，每瓶接种1个鳞茎块，每个处理接种30瓶，重复3次，培养基pH值调为5.8～6.0，培养温度(25±2) ℃，日光灯光源，光照时间12～14 h/d，光照强度1500～2000 lx。培养3周起每隔1周统计鳞茎愈伤组织诱导率和出芽率，培养8周后观察并记录鳞茎诱导情况。

1.2.4 光照强度试验 以前4周以MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖45 g/L为培养基，之后以MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+蔗糖15 g/L为培养基，采用暗培养(完全黑暗条件)、光培养(光照时间12～14 h/d，光照强度1500～2000 lx)和两者结合3种方式进行培养。A：接种后一直暗培养；B：接种后一直光培养；C：接种后先暗培养4周，再进行光培养。每瓶接种1个鳞茎块，每个处理接种30瓶，重复3次，培养基pH值调为5.8～6.0，培养温度(25±2) ℃，培养8周后观察并记录鳞茎诱导情况。

1.3 数据处理

愈伤组织诱导率/%=诱导愈伤组织鳞茎数/接种外植体总数×100

出芽率/%=诱导成芽鳞茎数/诱导愈伤组织鳞茎数×100

平均出芽数=出芽数总和/出芽鳞茎数。

采用Microsoft Excel 2007和IBM SPSS 19.0软件对数据进行方差分析和因素内多重比较并制图。

2 结果与分析

2.1 培养基对鳞茎诱导的影响

培养8周后统计不同培养基上大百合鳞茎愈伤组织诱导率、出芽率和平均出芽数，结果见图1。WPM、White和Nitsch 3种培养基的愈伤组织诱导率、出芽率和平均出芽数均低于MS、B5和N6培养基。MS培养基愈伤组织诱导率最高为81.11%，N6出芽率最高，为58.2%，但与MS培养基的差异不是特别明显，但在出芽数方面，MS培养基(6.32个)显著高于N6(4.51个)和B5(2.83个)培养基，故综合分析，MS较适合作为大百合鳞茎诱导的基本培养基。

图1 不同培养基对大百合鳞茎诱导的影响

2.2 激素配比对鳞茎诱导的影响

由表1可知，不同激素配比对于大百合鳞茎诱导的影响差异显著。对比处理1和处理2，愈伤组织的诱导率、出芽率和平均出芽数差异均不明显，说明ZT对于大百合鳞茎诱导的影响不是很大，而ZT价格较贵，可直接选择6-BA与NAA组合。对比处理2和处理3，由此可知，NAA相比IBA更有利于愈伤组织诱导，但相同浓度的IBA更有利于出芽。对比处理1和处理4，说明KT在大百合鳞茎诱导方面效果不如6-BA明显。对比处理3和处理7，处理5和处理6可知，降低6-BA浓度，愈伤组织诱导率下降，但出芽率和出芽数增加。对比处理7、8和9可知，在一定范围内增加IBA浓度，出芽率和出芽数增加，但当IBA增加到1 mg/L时，出芽数虽然会增加，但增加效果并不明显，而且出芽率会明显降低。综合分析可知，较高浓度的6-BA(5 mg/L)+较低浓度的NAA(0.1 mg/L)有利于愈伤组织的形成，愈伤组织诱导率可达(81.11%)；较低浓度的6-BA(0.5 mg/L)+较高浓度的IBA(0.5 mg/L)更有利于出芽，出芽率为76.39%，平均出芽数为10.64个。所以，在大百合鳞茎诱导时，可以先用5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培养基诱导愈伤组织，然后再转入0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA培养基诱导愈伤组织出芽。

表1 不同激素配比对大百合鳞茎诱导的影响

注：同列数据后的小写字母表示在0.05水平上的差异显著性，字母不同则差异显著，相同则不显著。

2.3 蔗糖浓度对鳞茎诱导的影响

由图2可知，大百合愈伤组织诱导开始的时间与蔗糖浓度关系不是很大，在培养3周时，均产生愈伤组织。大百合鳞茎诱导出芽时间与蔗糖浓度有关，蔗糖浓度越低，鳞茎出芽越早。随着培养时间的增加，出芽率和出芽数在不同蔗糖浓度处理间无明显差异，但在愈伤组织诱导率方面，培养初期(5周之前)45 g/L蔗糖浓度处理的愈伤组织诱导率最高，随着时间增加，30 g/L蔗糖浓度处理的高于其他2种蔗糖浓度。因此，在大百合组鳞茎诱导过程中，可根据不同的培养基，选择不同的蔗糖浓度，即在短期内诱导产生愈伤组织时，可在培养基中添加45 g/L蔗糖；想要获得大量的愈伤组织，可在培养基中添加30 g/L蔗糖；在后期诱导愈伤分化出芽时可降低蔗糖浓度到15 g/L。

图2 蔗糖浓度对大百合鳞茎诱导的影响

2.4 光照强度对鳞茎诱导的影响

由图3可知，3种培养方式对于愈伤组织诱导影响差异不明显，主要影响出芽效果。完全暗培养(A)的出芽率和出芽数较低，完全光培养(B)的愈伤组织诱导率较低，但出芽率和出芽数较完全暗培养有所增加，先进行暗培养然后再进行光培养(C)的不仅愈伤组织诱导率最高，而且出芽率和出芽数均最高，是大百合鳞茎诱导的最佳培养方式。

3 讨论与结论

目前，有关大百合组织培养的研究相对较少，多数研究直接采用MS作为基本培养基，尚未见比较不同培养基对于其鳞茎诱导出芽的影响研究。而不同植物对营养水平的要求不同[14-18]，培养基中无机盐成分、源的存在方式对植物组培影响较大，只有恰当的NO3-/NH4+比，才更有利于细胞的生长[16]。本试验比较了6种常用培养基对大百合鳞茎诱导的影响，发现MS较适合作为大百合鳞茎诱导的基本培养基。

激素对组织和细胞的增殖、分化等均起着关键的作用[17]，培养物对激素的需要量取决于其自身内源激素的水平，而这一水平随植物种类、组织的部位等条件变动[19]，故在植物组织培养过程中，通常需要进行激素种类和浓度的配比筛选试验，常用的激素主要有6-BA、KT、IAA、NAA、IBA等[20-21]。在大百合鳞茎诱导的报道中，多数研究者只将6-BA和NAA用来配比，而对于其他激素的作用，在大百合鳞茎诱导时罕见报道。本研究对比了常用的5种激素的效果发现，6-BA与KT对大百合鳞茎的诱导和不定芽的形成都有促进作用，但KT的作用效果不如6-BA明显，这与路艳等[5]的研究结果一致。同时，本试验研究还发现：6-BA的浓度对于愈伤组织诱导和出芽的影响较关键，高浓度的6-BA有利于诱导产生愈伤组织，但出芽效果不够理想；低浓度的6-BA虽然愈伤组织诱导率不高，但更有利于诱导出芽。张彦妮[22]和林贵美[23]等研究6-BA对百合组培的影响时，也提出了高浓度的6-BA会抑制不定芽的产生，与本研究结果类似。

图3 光照强度对大百合鳞茎诱导的影响

植物组织培养不仅受到激素的影响，还有其他一些因子也会发挥作用，如蔗糖[24]和光照[25]等。多数学者研究时将蔗糖作为了一个固定的量来试验，而蔗糖是培养基的能源物质和渗透调节剂，在组培的不同阶段浓度要求不同。本试验设置3个蔗糖浓度发现，在相对较短时间内获得愈伤组织可以添加较高的蔗糖浓度，在出芽阶段应该降低蔗糖浓度。此外，大量研究表明：光照对植物组织培养具有重要作用[26]，本研究发现光照强度对于出芽效果影响较明显，在大百合鳞茎诱导时应选择合适的光照进行培养。

本试验对大百合鳞茎诱导的影响因素进行研究，综合分析得出以下结论：MS是较适合的基本培养基，前4周以MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖45 g/L为培养基诱导愈伤组织，同时采用暗培养，之后以MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+蔗糖15 g/L为培养基诱导愈伤组织分化出芽，采用光培养，日照时间12～14 h/d，光照强度1500～2000 lx，此种诱导培养方式可使诱导率达到88.89%，出芽率达到93.82%，平均出芽数达到12.3。