常青，彭暄

（福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002）

莲子又称莲籽、莲米、莲肉、莲蓬子，是睡莲科植物莲的成熟种子[1]。莲子有四大品系，主要分布在我国的福建、湖北、湖南、浙江、江苏、河北等地，有3000多年的种植历史，其中以湖南湘莲、福建建莲、浙江衢莲为上品，福建建宁和江西广昌分别作为“中国建莲之乡”和“中国白莲之乡”[2]。多糖是一类由多个单糖基通过糖苷键结合的方式形成的天然大分子物质，是生物体内除核酸、蛋白质以外的又一类重要生物分子[3]。

多糖最常用的提取方法为水提醇沉法，此方法提取的多糖常常含有较多杂质（如蛋白、色素等），所以需要对提取得到的多糖进行分离纯化[4]。为了能到达一个最佳的脱蛋白的效果，通常将酶法脱蛋白与sevag法脱蛋白联用[5]。多糖的纯化通常采用柱层析法，常用的凝胶填料有Sephadex和Sepharose两种。陈婵[6]采用水提法提取莲子多糖，但是提取率较低，同时也发现超声波对莲子多糖的提取具有强化作用，微波对莲子多糖的提取具有辅助作用。

但是超声波微波提取的莲子多糖分离纯化工艺尚未见报道，因此本文主要研究超声波微波提取的莲子多糖分离纯化工艺，通过酶法脱蛋白结合sevag法脱蛋白和经过DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝胶柱后冷冻干燥获得纯化的莲子多糖。通过考察不同的酶解温度（20、30、40、50、60、70 ℃）、酶解时间（40、50、60、70、80、90 min）、酶添加量（80、100、120、140、160 U/mL），得到蛋白酶酶解的最佳工艺，通过sevag法对酶法脱蛋白后的多糖进一步脱蛋白，得到sevag法脱蛋白的最佳工艺。将脱蛋白后的莲子多糖过DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝胶柱，用全波段紫外-可见光光谱扫描，对纯化后的多糖进行纯度鉴定。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

木瓜蛋白酶，索莱宝生物科技有限公司；牛血清蛋白、考马斯亮蓝染液、正丁醇、苯酚、葡萄糖、浓硫酸、氯仿、氯化钠等均为国产分析纯；DEAE-52纤维素、Sephadex G-20葡聚糖凝胶为美国Sigma公司；实验用水为蒸馏水。

1.2 主要仪器

DHL-A恒流泵：上海金朋分析仪器有限公司；

UV-1100型紫外可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司；

丹瑞HH-4型数显恒温水浴锅：上海亚荣生化仪器厂；

恒温水浴摇床：尤尼柯（上海）仪器有限公司；

玻璃层析柱（Φ16mm×400mm）：上海精科实业有限公司。

2 试验方法

2.1 莲子多糖的制备

取适量去心干莲子于植物粉碎机中粉碎，过40目筛，得莲子粉末样品。取5 g莲子粉末，置于卤素快速水分测定仪中测定粉末样品的水分含量，所制得莲子粉末的水分含量小于3%。取莲子粉末样品于锥形瓶，按液料比55 mL/g的比例加入二次蒸馏水，在超声波功率110 W和微波功率110 W的条件下提取70 s，样品浸提液离心（4000 r/min，20 min）得滤液，加入4倍体积的常温无水乙醇，室温下静置沉降20 h后，再次离心（4000 r/min，20 min）。弃上清液，取沉淀，用二次蒸馏水溶解沉淀后冷冻干燥，得莲子多糖。

2.2 多糖含量的测定

以葡萄糖为标准品，采用硫酸-苯酚比色法来测定莲子多糖[7]。

标准曲线溶液的配制：分别配制8、16、24、32、40 g/mL的葡萄糖溶液，分别吸取不同浓度的葡萄糖标准液2 mL，依次加入浓度为6%的苯酚1.0 mL，浓硫酸5.0 mL，显色后于冷水中冷却15 min，在波长490 nm处测定吸光度值，空白对照用蒸馏水做试剂空白。

实验结果得到的标准曲线：

表明在0～0.08 mg/mL范围内葡萄糖溶液浓度与吸光度OD值呈现良好的线性关系。

X--表示葡萄糖溶液浓度，单位mg/mL；

Y--表示吸光度OD值。

2.3 蛋白质含量的测定

牛血清蛋白标准曲线溶液的配制[8,9]：采用考马斯亮蓝法进行显色测定，以牛血清白蛋白为标准品，分别配制浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL牛血清白蛋白标准溶液，取1 mL加到试管中。加入考马斯亮蓝染液5.0 mL，混匀后室温下静置3 min，以试剂空白作对照，在波长595 nm处测定吸光值。

样品的测定：配制1 mg/mL的莲子多糖溶液，吸取样品液1.0 mL按照标准曲线测定的步骤测定吸光值，计算样品蛋白质的浓度。

牛血清蛋白标准曲线方程为y=0.0066x+0.0092，R2= 0.9994。表明浓度在0～0.1 mg/mL的范围内牛血清蛋白溶液的浓度与吸光度值的线性关系良好（见图1）。

2.4 脱蛋白试验

2.4.1 酶法脱蛋白

2.4.1.1 单因素试验

取莲子多糖粉末0.5 g，用蒸馏水溶解，定容至500 mL，以蛋白质的脱除率为指标，考察不同的酶解温度（20、30、40、50、60、70℃）、酶解时间（40、50、60、70、80、90 min）、酶添加量（80、100、120、140、160 U/mL）蛋白酶对蛋白质脱除率的影响。

2.4.1.2 正交试验

在单因素实验结果的基础上，以蛋白质脱除率为指标，综合考虑酶解温度（A）、酶解时间（B）、酶添加量（C）对除莲子多糖中蛋白质的脱除率的影响。

2.4.2 Sevag法

Sevag试剂的配制：将氯仿和正丁醇按照4∶1的比例配制。

取酶解脱蛋白后的莲子多糖样品液30 mL，加入10mL的Sevag试剂，用恒温水浴摇床振荡（200 r/min）20～30 min，离心（4000 r/min）20 min，取少量上清液测定蛋白质和多糖的含量，然后将溶液反复处理5次。按公式计算多糖损失率和蛋白脱除率。

M1：脱蛋白后的多糖含量（mg）

M2：脱蛋白前的多糖含量（mg）

C1：脱蛋白后的蛋白质浓度（mg/mL）

C2：脱蛋白前的蛋白质浓度（mg/mL）

2.5 DEAE-52纤维素柱分级

参照Zeng等[10]的方法进行稍加修改，将预处理后的DEAE-52纤维素填装于1.6 cm×60 cm的层析柱中，柱高40 cm。用去离子水配制浓度为30 mg/mL莲子多糖溶液，取10 mL加入DEAE-52纤维素柱上层析分级。0～19管用蒸馏水洗脱、20～120管用0～1 mol/L NaCl溶液进行洗脱，流速：30 mL/h，4 mL/管。

2.6 Sephadex G-20葡聚糖凝胶柱分级莲子多糖

将预处理好的Sephadex G-20葡聚糖凝胶填装于1.6 cm×40 cm的层析柱中，柱高30 cm。将DEAE-52纤维素柱分离的组分单次上样10 mL，样品浓度30 mg/mL。用NaCl溶液（0.1 mol/L）洗脱，流速：20 mL/h，每管4 mL，总共收集80管。用苯酚-硫酸法测定，在490 nm处用紫外-可见分光光度计隔管测吸光度值后，作洗脱曲线。收集吸收峰部分的莲子多糖，洗脱液氯化钠用透析法除去，将透析后的莲子多糖溶液浓缩冷冻干燥，即得分离的组分。

2.7 紫外-可见光谱扫描分析

分别取脱蛋白后和过DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝胶柱后的莲子多糖5 mg用蒸馏水溶解后定容至100 mL，用紫外-可见光谱进行全波段扫描，扫描波长间隔为0.5 nm。

3 结果与分析

3.1 莲子多糖脱蛋白试验

3.1.1 酶法脱蛋白

3.1.1.1 单因素实验

3.1.1.1.1 不同酶解温度对莲子多糖蛋白质脱除率的作用

从图2可知，温度在20～50 ℃范围内，随着酶解温度的升高，蛋白脱除率不断上升，这可能是因为温度升高，酶的活力增大，酶解速度加快[11]；当温度高于50℃时，蛋白脱除率呈下降趋势。这可能是因为当温度超过酶的最适温度后，酶蛋白质发生变性，酶的活力下降，酶解速度下降[12]。因此，酶解温度选择50℃。

图2 酶解温度对蛋白质脱除率的作用

3.1.1.1.2 不同酶解时间对莲子多糖蛋白脱除率的作用

从图3可知，当酶解时间为40～60 min 时，蛋白质脱除率不断上升，60 min后蛋白脱除率几乎不变。这可能是因为随着酶解反应时间的增加，酶与底物接触充分，蛋白质脱除率增大，反应时间太短，酶解不充分[13]；当时间达到一定时，底物浓度降低，酶反应达到饱和，蛋白的脱除效果受酶解时间的作用不大[14]。因此，最佳酶解时间为60 min。

图3 酶解时间对蛋白脱除率的作用

3.1.1.1.3 不同酶添加量对莲子多糖蛋白脱除率的作用

从图4可知，当酶添加量在80～120 U/mL范围时，蛋白质脱除率随着酶添加量的增加而增加；当酶添加量超过120 U/mL时，蛋白质脱除率呈现下降趋势。这可能是因为多糖溶液中的蛋白质，作为蛋白酶的作用底物，随着酶浓度的增加，酶反应速率加快，蛋白质脱除效果不断上升[15]；但是当酶浓度升高到一定程度时，蛋白酶的酶解底物不足，酶反应速率降低[5]。因此，最适酶添加量为120 U/mL。

图4 酶量对蛋白脱除率的作用

3.1.1.2 正交优化试验

3.1.1.2.1 因素水平表

在上述实验的基础上，以蛋白质脱除率为指标，综合考虑酶解温度、酶解时间、酶添加量对蛋白质脱除率的影响，使用SPSS13.0统计软件对正交实验结果进行分析处理。根据单因素试验结果设计3因素、3水平的正交试验表（表1）。

3.1.1.2.2 莲子多糖脱蛋白最佳工艺条件的确定

蛋白酶酶法脱蛋白正交试验结果见表2。

由表2可知，比较Rj值得大小，RC＞RB＞RA，即在所设定的因素中，C因素对蛋白质脱除的作用最大，其次是B因素，A因素。对正交试验进行直观分析，将K值进行比较可知，A2B3C2为优水平组合，即酶解温度为50 ℃，酶解时间为70 min，木瓜蛋白酶添加量为120 U/mL时，蛋白质的脱除率最大。

表1 正交试验因数和水平表

表2 正交试验结果

表3 正交试验方差分析

由表3可知，B和C因素作用显著，A因素作用不显著，所以需对酶解时间B和酶添加量C因素的各水平进行多重比较。

多重比较的结果以B1、B3和C2为最好，根据实际情况，B因素选择B1，由于A因素不显著，故根据实际情况A因素选择第1水平，由方差分析和多重比较可得出优方案为A1B1C2。由于与正交试验中的优水平组合不一致，需做进一步的验证实验，进一步的验证试验的结果为：组合A1B1C2蛋白质的脱除率为74.25%，由验证试验的结果可得此次试验的最优方案为A1B1C2，此时，多糖的损失率为5.88% 。

表4 B因素各水平均值多重比较

表5 C因素各水平均值多重比较

3.1.2 Sevag法脱蛋白

经蛋白酶处理后的莲子多糖，采用sevag法做进一步的处理，蛋白质脱除率和多糖损失率情况如图5所示。

图5 Sevag试剂处理结果

从图5可知，sevag法脱蛋白2次后，蛋白质脱除率到达最大，多糖损失率不断上升。综上，最佳方案为sevag法脱蛋白2次，此时蛋白质脱除率和多糖损失率分别为85.5%和7.5%。

3.1.3 最佳工艺的确定

莲子多糖的最佳脱蛋白工艺为：酶解温度50 ℃、酶解时间50 min、木瓜蛋白酶添加量120 U/mL，此时蛋白质脱除率和多糖的损失率分别为74.25%和5.88%。再用sevag试剂处理2次，此时蛋白质脱除率为85.5%，多糖损失率为7.5%。

3.2 莲子多糖的梯度洗脱

莲子多糖经DEAE-52纤维素柱线性洗脱分级得到单一组分LSPs-1（如图6所示），这与陈婵[6]的结果一致。将35-58管收集经透析、浓缩和冷冻干燥后得到纯化后的莲子多糖，经测定该组分的回收率为90.18%，说明莲子多糖已基本洗脱出来。

采用Sephadex G-20葡聚糖凝胶柱层析对经DEAE-52纤维素柱纯化后莲子多糖作进一步的分离纯化试验。经DEAE-52纤维素柱纯化后的单一组分用Sephadex G-20葡聚糖凝胶柱层析洗脱曲线如图7所示，经透析、浓缩和冷冻干燥后得到更纯的莲子多糖LSPs-1-1。

图7 莲子多糖P1的Sephadex G-20葡聚糖凝胶柱层析洗脱曲线

3.3 纯度鉴定

从图8可知，脱蛋白后的莲子多糖在280 nm处无明显的吸收峰，相比脱蛋白前的莲子多糖吸收峰小得多，说明经过酶法和sevag法脱蛋白后莲子多糖中的蛋白质已基本被除净。

图8 脱蛋白前后紫外-可见光谱全波段扫描图

图9 过柱后紫外-可见光谱全波段扫描图

从图9可以看出，经过DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝胶柱后的莲子多糖在280 nm处无蛋白质吸收峰，说明经过DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝胶柱后的莲子多糖已经没有蛋白质，此时的莲子多糖是一个纯的莲子多糖。这与陈婵[6]的研究结果一致，陈婵用DEAE-SephadexA-25分离莲子多糖后得到一个组分，经Sephrose CL-4B凝胶层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析得到莲子多糖为纯品。

4 结论

⑴采用蛋白酶酶解和sevag试剂处理后，得到莲子多糖的酶法脱蛋白最佳工艺为：酶解温度为50 ℃、酶解时间为50 min和木瓜蛋白酶添加量为120 U/mL，在此工艺条件下，蛋白质脱除率和多糖的损失率为74.25%和5.88%。经sevag试剂处理2次后，此时蛋白质脱除率为85.5%，多糖损失率为7.5%。

⑵采用DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝胶柱对莲子多糖进行纯化，纯度鉴定采用紫外-可见光谱扫描法，结果表明，此分离纯化的方法能得到单一组分莲子多糖，该多糖组分均无蛋白质和核酸的吸收峰，说明该法能得到纯度较高的多糖。