张 涛 范君文 李 丹 李文龙 孙兆增 贺喜兵 曾 林 邱业峰

(军事医学研究院实验动物中心，北京 100071)

CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 及其相关的Cas基因系统是最新涌现的一种基因组编辑工具，因其操作简便、效率高而成为热门的基因编辑技术。该系统是细菌和古生菌抵抗外源基因侵入的获得性免疫系统，侵入宿主的噬菌体或质粒 DNA片段整合到 CRISPR 位点，然后在 CRISPR RNAs (cr RNAs) 引导下由Cas 核酸内切酶切割外源侵入DNA序列[1]，造成DNA 双链断裂，DNA双链断裂后激活细胞的同源末端重组或非同源末端连接机制对断裂的 DNA 进行修复，达到对基因组定点修饰的作用[2]。Cas 基因编码的蛋白具有核酸酶和解旋酶结构域[3]。在Cas 基因附近有一段帮助 cr RNAs 成熟的转录活化 RNA (Trans-activating cr RNA，tracr RNA)，tracr RNA 促进 pre-cr RNA 的成熟，形成具有切割活性的 cr RNA-tracr RNA-Cas9三元复合体[4]。与锌指核酶(ZFN)以及转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)技术相比，CRISPR/Cas9 系统具有操作更简便、靶点选择更灵活、活性更高等优势。

TP53为含锌转录因子，直接作用或间接调节其下游基因的表达，在DNA修复、细胞周期捕获、细胞凋亡、分化等过程中起重要作用[5- 6]。肿瘤抑制基因TP53在人类癌症发生中突变频率最高[7]，该基因为显性失活，一个等位基因灭活就可以导致TP53基因功能失活[8]。TP53基因突变与功能丧失是卵巢癌中最常见的基因异常之一，卵巢癌患者中约26%～62%存在该基因突变，约50%的晚期卵巢癌患者p53蛋白功能失活，主要为浆液性、低分化卵巢癌[9- 10]。

本研究利用CRISPR/Cas9慢病毒载体系统构建TP53基因敲除小鼠原代卵巢上皮细胞系，并对细胞的生物学特性进行分析。……