金万虎，张平，金铁峰，李春国

（1.延边大学附属医院 妇科，吉林 延吉133000；2.延边大学附属医院 疼痛科，吉林延吉133000；3.延边大学 肿瘤研究中心，吉林 延吉133000；4.吉林省吉林市中心医院 肿瘤科，吉林 吉林 132011）

宫颈癌是我国女性肿瘤发病率第2位的恶性肿瘤，近年来其发病率逐年升高[1-2]。上皮间质转换（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是肿瘤在侵袭、浸润过程中的重要功能及形态学改变。有研究证实，宫颈癌常以EMT的形式发生间质浸润并向远处转移[3-4]。有研究表明，PI3K和mTOR双重靶向抑制剂BEZ235及EMT靶向抑制剂AZD6244具有一定的抗肿瘤作用[5-6]。但用药过程中出现的毒副作用严重制约其疗效，且两药合用是否具有协同作用研究较少，故实验通过联合应用BEZ235、AZD6244，探讨其抑制人宫颈癌的作用机制，为小分子靶向治疗药物治疗宫颈癌提供有效的实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌Hela和SiHa细胞株常规冻存于延边大学肿瘤研究中心，胎牛血清、RPMI 1640培养基、胰蛋白酶、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）等化学试剂购自北京华美公司，Western blot检测相关试剂、MTT试剂购自武汉博士德生物有限公司，EMT标志物蛋白E-cadherin、ZO-1、Vimentin及Snail抗体购自美国Cell Signaling公司。

1.2 MTT比色法

采用MTT比色法检测细胞增殖能力。将宫颈癌细胞株Hela（腺癌）及SiHa（鳞癌）接种于含10%胎牛血清、5%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中，37℃、5%二氧化碳CO2常规培养，0.25%胰酶消化并传代。将处于对数生长期的Hela和SiHa细胞按2×103个/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后加入终浓度为 0.0、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0和100.0 nmol/L的 BEZ235和 1、3、10、30、100、300和1 000 nmol/L的AZD6244，每种浓度分别设3个平行复孔，对照组加入等体积的培养液。72 h后加入50μl/孔MTT，反应4 h后弃上清，加入200μl/孔DMSO，轻轻震荡数分钟，应用瑞士Tecan公司生产的全波长多功能酶标仪（型号Infinite 200 PRO），在570 nm波长处测定其吸光值，并按公式计算细胞生存率。细胞生存率（%）=实验组吸光值／对照组吸光值×100%。

1.3 划痕愈合实验

采用划痕愈合实验检测细胞迁移能力。将密度为5×105个/ml的Hela和SiHa细胞接种于6孔板中，2 ml/孔，孵育24 h。待细胞完全贴壁，用10μl移液枪枪头在单层细胞上划一条直线，用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗3次，分别加入普通培养基、含BEZ235的培养液、含AZD6244的培养液，以及同时含AZD6244、BEZ235的培养液，24 h后观察并拍照。

1.4 Western blot检测

Hela和 SiHa细 胞 经 BEZ235、AZD6244， 以及BEZ235联合AZD6244作用24 h，用PBS洗2次后提取总蛋白。采用Bradford法测定蛋白浓度，8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行蛋白分离，转至聚偏二氟乙烯膜上。室温下摇床封闭（TBST+5%脱脂奶粉）2 h，加入兔抗人E-cadherin、Vimentin和β-actin的单克隆抗体，4℃过夜。室温下洗膜，加入辣根过氧化物酶偶联羊抗兔IgG二抗，孵育2 h。采用增强化学发光法曝光，观察并拍照。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BEZ235联合AZD6244抑制Hela和SiHa细胞增殖

BEZ235、AZD6244单独或联合应用处理细胞72 h。MTT结果显示，BEZ235对Hela和SiHa细胞的半数抑制率（half maximal inhibitory concentration, IC50）分 别 为 19.41和 62.51 nmol/L。AZD6244对 Hela和SiHa细胞的IC50分别为302.31和511.04 nmol/L（见图1）。两药联合应用协同抑制Hela和SiHa细胞增殖，联合用药指数（combination index, CI）分别为0.51和0.64，具有较好的协同抑制效果（见图2）。

2.2 BEZ235联合AZD6244对Hela细胞迁移能力的影响

MTT结果显示，BEZ235联合AZD6244对Hela细胞的协同作用更明显（CIHela＜CISiHa）。笔者在体外培养的Hela单层细胞上划痕致伤，分别以半数抑制率浓度的BEZ235（20 nmol/L）和AZD6244（300 nmol/L）联合作用48 h。对照组、BEZ235组、AZD62444组、联合用药组的细胞迁移率分别为（83.88±1.48）%、（65.52±3.46）%、（75.50±3.72）% 和（50.82±1.95）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=76.289，P=0.000）。进一步两两比较经SNK-q检验，联合用药组比对照组、BEZ235组、AZD62444组抑制Hela细胞迁移能力更强（P＜0.05）。见图3、4。

图1 BEZ235、AZD6244抑制Hela和SiHa细胞增殖 （±s）

图2 BEZ235联合AZD6244协同抑制Hela和SiHa细胞增殖 （±s）

图3 BEZ235、AZD6244协同抑制Hela细胞迁移

图4 各组Hela细胞迁移率比较 （±s）

2.3 BEZ235、AZD6244对EMT相关标志蛋白表达的影响

20 nmol/L BEZ235和300 nmol/L AZD6244分别单独或联合作用于Hela细胞48 h后，与单独用药组及未加药对照组比较，宫颈癌细胞由三角形或多角形变为长梭形。对照组、BEZ235组、AZD62444组、联合用药组的E-cadherin蛋白相对表达量分别为（22.04±0.58）、（98.42±3.86）、（51.33±5.22）、和（33.61±3.67），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=9.164，P=0.012）；对照组、BEZ235组、AZD62444组、联合用药组的ZO-1蛋白相对表达量分别为（38.86±3.08）、（28.44±1.12）、（39.93±5.23）和（58.10±3.26），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=37.311，P=0.000）；对照组、BEZ235组、AZD62444组、联合用药组的Vimentin蛋白相对表达量分别为（28.60±1.33）、（21.05±0.88）、（30.67±1.64）和（10.15±1.08），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=11.051，P=0.006）；对照组、BEZ235组、AZD62444组、联合用药组的Snail蛋白相对表达量分别 为（10.63±0.96）、（6.32±0.43）、（5.2±0.88） 和（1.22±0.12），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=94.783，P=0.000）。进一步两两比较经SNK-q检验，联合用药组较BEZ235组E-cadherin、ZO-1蛋白表达升高（P＜0.05），Snail、Vimentin蛋白表达降低（P＜0.05）；联合用药组较 AZD6244组E-cadherin、ZO-1蛋白表达升高（P＜0.05），Snail、Vimentin 蛋白表达降低（P＜0.05）。联合用药组相对于BEZ235组、AZD6244组抑制EMT的能力更强。见图5、6。

图5 各组EMT相关标志蛋白的表达

图6 BEZ235与AZD6244协同抑制Hela细胞EMT形成 （±s）

3 讨论

癌细胞的侵袭及转移是导致宫颈癌预后差，难以治愈的重要因素[7]。PI3K-Akt和EMT-ERK信号通路是EGFR下游经典信号通路，在肿瘤发生、发展过程中起到非常重要的作用。PI3K-Akt和EMT-ERK信号通路被激活后，产生一系列的连锁反应，包括细胞增殖能力、血管新生能力、炎症反应等均得到增强。因此，通过抑制PI3K信号通路的活性，从而达到攻克肿瘤的目的一直是肿瘤研究领域的重量级课题[8-9]。大量研究证实，单独阻断PI3K/Akt或EMT/ERK信号通路虽然可以部分抑制肿瘤生长，但是肿瘤细胞仍可以通过其他信号通路途径增殖及发生转移。多信号通路阻断剂联合应用可以弥补该不足[10-11]。EMT是肿瘤细胞突破基底膜向间质浸润和远处转移的早期事件，有众多基因及信号通路参与其中[12]。EMT过程中，上皮志物E-cadherin、ZO-1等表达下调，而间质标志物vimentin、Snail等表达上调，使肿瘤细胞脱离原发病灶，突破基底膜最终形成远隔转移[13]。

本研究通过对比分析发现，BEZ235、AZD6244联合应用可以在体外协同抑制宫颈癌细胞的增殖及迁移。MTT比色法观察BEZ235、AZD6244联合用药对人宫颈癌细胞株Hela和SiHa的生长抑制情况，发现联合用药组较BEZ235组、AZD6244组、对照组抑制作用更强。笔者在划痕实验中发现，用药48h后BEZ235联合AZD6244显著抑制Hela细胞的迁移。为进一步探明BEZ235、AZD6244协同抑制宫颈癌细胞迁移的分子机制，用Western blot检测EMT相关信号通路蛋白表达的影响，发现联合应用BEZ235、AZD6244，Hela细胞上皮表型明显增强，而间质表型受到抑制，提示BEZ235、AZD6244联合应用抑制宫颈癌细胞的迁移可能是通过抑制其EMT途径而实现的。

本研究结果证实，BEZ235联合AZD6244可以在体外协同抑制宫颈癌细胞增殖，并通过抑制EMT途径抑制宫颈癌细胞的迁移，因此本研究对临床治疗宫颈癌提供了新的理论依据及实验基础。