不同品种嘉宝果叶片提取物的抗氧化活性
2018-08-10林宝妹邱珊莲张少平林巧莉郑开斌
林宝妹，邱珊莲，张少平，林巧莉，郑开斌
(福建省农业科学院 亚热带农业研究所，福建 漳州 363005)
嘉宝果(MyrciariacaulifloraBerg)又名拟爱神木、树葡萄，为桃金娘科拟香桃木属果树，是一种生长缓慢的热带、亚热带常绿乔木或灌木,原产于巴西，在玻利维亚、巴拉圭、阿根廷东北部、乌拉圭、秘鲁等地也有分布[1-2]。嘉宝果在我国台湾地区引种较早，始于20世纪80年代末，大陆地区于2003年从台湾嘉义引进，目前已发展成新兴的热带水果。嘉宝果树枝叶繁茂，一年可4次开花结果，花果着生于树干或枝条上，观赏性强。嘉宝果果实圆润小巧呈深紫色，皮厚且多纤维，果肉多汁、甘甜，其中含有多种芳香成分，如萜烯类、有机酸类、醇类等，因此果实香气四溢[3-5]；果实低糖低脂，含有多种人体所需营养元素、矿物质及微量元素，如钙、磷、铁、Vc、氨基酸等，可鲜食，还可制成果酱、果酒、果醋等营养保健品，价格高昂，具有良好的经济效益[4-7]。另外，嘉宝果果实含有丰富的花青素、类黄酮、酚酸、单宁以及较少见的缩酚酸等酚类物质，因此具有良好的抗氧化、抗炎、降低胆固醇水平、抗恶性肿瘤细胞增殖、降低血糖等生物活性，可用于治疗慢性炎症疾病、糖尿病、高血脂等[8-12]。综上所述，嘉宝果是一种集观赏、食用、经济、药用等多种价值于一体的名贵优良树种，极具开发研究价值。
近年来，随着人们对自由基破坏细胞结构和功能研究的深入，抗氧化剂研究越来越受到关注。抗氧化剂可以抑制自由基的产生及其氧化作用，保护生物大分子如DNA、蛋白质及脂质等[13]，防止或延缓许多疾病的发生和发展，如糖尿病及其并发症。目前常用的抗氧化剂多为人工合成，存在安全性及毒性问题。因此，从植物中寻找安全有效的天然抗氧化剂已成为发展趋势和研究热点。国内外的研究结果表明，嘉宝果树的果实、果皮和种子等具有良好的抗氧化性[12,14-16]，但是对嘉宝果叶片的抗氧化作用尚未见报道。本试验选取嘉宝果树4个品种的嫩/老叶作为研究对象，分别用水和不同体积分数乙醇进行提取，检测提取物的总多酚和总黄酮含量及抗氧化活性，探讨总多酚、总黄酮含量与抗氧化活性的相关性，以期能筛选出具有较强抗氧化活性的品种和提取液，为嘉宝果树叶的开发提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
试验于2016-12-2017-04在福建省农业科学院亚热带农业研究所进行。供试嘉宝果品种有沙巴、四季早生、福冈、阿根廷，树龄5年。2016-12-08在福建龙海市惠昌树葡萄专业合作社采样，各嘉宝果品种随机选取9株，分别剪取嫩叶(枝条顶部、质地柔嫩且叶脉不清晰者)和老叶(枝条近树干侧、质地较硬且叶脉清晰者)，备用。1,1-苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)、2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS+)、邻二氮菲(P9375-5G)，购于美国Sigma公司；标准品没食子酸、芦丁，购于日本东京化成工业株式会社；抗坏血酸(Vc)、无水乙醇、95%乙醇(体积分数，下同)、双氧水、硫酸亚铁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钠，购于国药集团化学试剂有限公司。
1.2 设备和仪器
紫外可见分光光度计，L5S型，上海仪电分析仪器有限公司；超纯水机，UPW-20N型，北京历元电子仪器有限公司；分析天平，BS110S型，德国Sartorius集团；水浴锅，HH·S21-8-S型，上海新苗医疗器械制造有限公司；台式冷冻恒温振荡器，THZ-C-1型，苏州培英实验设备有限公司；粉碎机，WBL2521H型，佛山美的集团；旋转蒸发仪，RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂；电热鼓风干燥箱，GZX-9246MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3 试验方法
1.3.1 嘉宝果叶片提取液的制备 将采集的嘉宝果新鲜叶片用粉碎机粉碎1 min(28 000 r/min)，取适量粉碎样品与不同溶剂(水、体积分数50%和70%乙醇、无水乙醇)按1∶10的质量(g)体积(mL)比混合，在摇床(30 ℃，180 r/min)中振荡提取16 h，再以6 000 r/min离心15 min，取上清，用旋转蒸发仪浓缩至冷凝管中无溶剂滴出为止。浓缩液用水溶解定容至10 mL，未见沉淀，4 ℃保存，待测。另取一部分叶片，称其鲜质量后，烘干至恒质量，计算干物质占比。样品质量浓度以每毫升水溶液含有的新鲜叶片质量计，单位为mg/mL。
1.3.2 总多酚含量的测定 参照刘禹等[17]的方法并作适当修改进行试验。取0.1 mL样品液，加入0.1 mL 1.0 mol/L Folin-Ciocalteu试剂和2.8 mL水，混匀，静置8 min后加入2 mL 75 g/L碳酸钠溶液，摇匀，室温下密封避光2 h，于765 nm处测其吸光度(D765 nm)，平行测定3次。以没食子酸为标准品，建立方程：y=0.002x+0.061(R2=0.995 2)；式中：y为D765 nm值，x为没食子酸质量浓度(0～300 μg/mL)。不同提取液中多酚含量用每克干燥叶片中所含的相当于没食子酸(GAE)的量进行计算，单位为mg/g。试验重复3次。
1.3.3 总黄酮含量的测定 参照刘禹等[17]的方法并作适当修改进行试验。取1 mL样品液，加入0.5 mL 50 g/L亚硝酸钠溶液，混匀，静置6 min后加入0.5 mL 100 g/L硝酸铝溶液，摇匀静置6 min，然后加入4 mL 40 g/L氢氧化钠溶液，最后加入水定容至10 mL，静置15 min，于510 nm处测其吸光度(D510 nm)，平行测定3次。以芦丁为标准品，建立方程：y=1.250x-0.001(R2=0.999 9)；式中：y为D510 nm值，x为芦丁质量浓度(0～60 μg/mL)。不同提取液中总黄酮含量用每克干燥叶片中所含的相当于芦丁(RE)的量进行计算，单位为 mg/g。试验重复3次。
1.3.4 抗氧化活性的测定 DPPH·自由基清除能力的测定参照Li等[18]的方法并稍作改动进行试验。DPPH·溶剂为体积分数95%乙醇，以抗坏血酸为对照品，建立方程：y=948.763x+1.626 (R2=0.996 6),式中：y为DPPH·自由基清除率，x为抗坏血酸质量浓度(20～100 μg/mL)。羟自由基(·OH)清除能力的测定参照Caillet等[19]的邻二氮菲法，以抗坏血酸为对照品，建立方程：y=31.298x-33.209(R2=0.996 8),式中：y为·OH自由基清除率，x为抗坏血酸质量浓度(1.800～3.600 mg/mL)。ABTS+自由基清除能力的测定采用Hu等[20]的方法，以抗坏血酸为对照品，建立方程：y=596.050x+3.274(R2=0.999 5),式中：y为ABTS+自由基清除率，x为抗坏血酸质量浓度(20～100 μg/mL)。自由基清除试验中样品均设5个浓度梯度，最高浓度设定为使自由基清除率达50%～100%的浓度，最低浓度设定为使自由基清除率达0～20%的浓度。以样品质量浓度为自变量，自由基清除率为因变量，绘制回归曲线，求回归方程，计算自由基清除率为50%时的样品浓度，最终以样品干质量浓度表示半数清除浓度(EC50)，每组试验重复3次。自由基清除率的计算公式如下：
DPPH·清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。
式中：A0为对照管D517 nm值，Ai为样品管D517 nm值，Aj为样品本底D517 nm值。
·OH清除率=[(A2-A1)/(A0-A1)]×100%。
式中：A0为未损伤管D510 nm值，A2为样品管D510 nm值，A1为损伤管D510 nm；
ABTS+清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。
式中：A0为对照管D734 nm值，Ai为样品管D734 nm，Aj为样品本底D734 nm值。
1.4 统计分析
采用SPSS 22.0统计软件进行提取物总多酚、总黄酮含量与抗氧化活性相关性分析和单因素方差分析。数据用“平均值±标准误”表示。
2 结果与分析
2.1 不同品种嘉宝果叶片提取物中的总多酚含量
不同品种嘉宝果叶片的干物质百分比见表1。根据表1 数据计算样品总多酚含量，结果见表2。
表1 不同品种嘉宝果叶片干物质的百分比Table 1 Dry weight ratios of leaves from different cultivars of Jaboticaba %
表2结果表明，无论用哪种溶剂提取，各嘉宝果品种嫩叶的总多酚含量均高于同品种老叶，最高的为沙巴嫩叶(273.70 mg/g)；各嘉宝果品种嫩叶总多酚含量为0.12～273.70 mg/g，老叶为6.82～151.55 mg/g，4个品种老叶水提取物中均未检测到总多酚。由表2可见，各嘉宝果品种叶片提取物中的总多酚含量均表现为醇提取物极显著高于水提取物(P<0.01)，总多酚含量高低依次表现为 70%乙醇提取物>50%乙醇提取物>无水乙醇提取物>水提取物。4个嘉宝果品种，70%和50%乙醇提取物总多酚含量的变化规律一致，由高到低依次表现为沙巴嫩叶>四季早生嫩叶>阿根廷嫩叶>四季早生老叶>福冈嫩叶>阿根廷老叶>沙巴老叶>福冈老叶；无水乙醇提取物中总多酚含量以沙巴嫩叶最高，沙巴老叶最低；水提取物总多酚含量以沙巴嫩叶最高，阿根廷嫩叶最低。
表2 4个品种嘉宝果叶片不同溶剂提取物中的总多酚含量比较 Table 2 Comparison of total polyphenols (TP) contents of leaf extracts of different solvents from 4 Jaboticaba cultivars mg/g
注：-表示未测到。同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。
Note:-Means not detected.Different small letters in the same column indicate significant different at 0.05 level (P<0.05) and different capital letters in the same column indicate significant different at 0.01 level (P<0.01).The same below.
2.2 不同品种嘉宝果叶片提取物中的总黄酮含量
表3结果表明，无论用哪种溶剂提取，各嘉宝果品种嫩叶的总黄酮含量均高于同品种老叶，总黄酮含量最高为阿根廷嫩叶(213.45 mg/g)；嫩叶总黄酮含量为23.12～213.45 mg/g，老叶为6.28～130.65 mg/g。
由表3可见，各嘉宝果品种均表现为醇提取物中总黄酮含量高于水提取物，醇提取物中总黄酮含量以阿根廷嫩叶最高，其次为四季早生嫩叶；水提取物中总黄酮含量以沙巴嫩叶最高，其次为四季早生嫩叶。除沙巴嫩叶、四季早生嫩叶和福冈老叶外，其他叶片各溶剂提取物总黄酮含量均表现为：70%乙醇提取物>50%乙醇提取物>无水乙醇提取物>水提取物。
表3 4个品种嘉宝果叶片不同溶剂提取物中的总黄酮含量比较Table 3 Comparison of total flavonoid (TF) contents of leaf extracts of different solvents from 4 Jaboticaba cultivars mg/g
2.3 不同品种嘉宝果叶片提取物对DPPH·自由基的清除能力
不同品种嘉宝果叶片提取物对DPPH·自由基的清除效果见表4。表4表明，4个品种叶片不同溶剂提取物均对DPPH·自由基有一定的清除效果，同品种嫩叶提取物对DPPH·自由基的清除能力均高于老叶，线性相关系数0.960 4
表4 4种嘉宝果叶片不同溶剂提取物清除DPPH·自由基效果的比较Table 4 Comparison of scavenging effects on DPPH·radical of leaf extracts of different solvents from 4 Jaboticaba cultivars
注：回归方程中，x表示样品质量浓度，y表示自由基清除率。下表同。
Note:In the regression equation,xrepresents the concentration of sample andyrepresents the scavenging rate of free radical.The same below.
2.4 不同品种嘉宝果叶片提取物对·OH自由基的清除能力
不同品种嘉宝果叶片提取物对·OH自由基的清除效果见表5。由表5可见，除沙巴老叶、四季早生嫩叶外，其余叶片不同溶剂提取物清除·OH自由基的能力大小依次表现为：50%乙醇提取物>70%乙醇提取物>无水乙醇提取物>水提取物。沙巴嫩叶50%和70%醇提取物清除·OH自由基的能力最强，EC50均为0.128 g/L，远超现在普遍接受的抗氧化剂抗坏血酸对·OH自由基的清除能力(EC50=2.659 g/L)。此外，沙巴嫩叶、四季早生嫩叶、福冈嫩叶水提取物对·OH自由基的清除能力也都高于抗坏血酸。
表5 4种嘉宝果叶片不同溶剂提取物清除·OH自由基效果的比较Table 5 Comparison of scavenging effects on ·OH radical of leaf extracts of different solvents from 4 Jaboticaba cultivars
2.5 不同品种嘉宝果叶片提取物对ABTS+自由基的清除能力
不同品种嘉宝果叶片提取物对ABTS+自由基的清除效果见表6。由表6可见，与·OH自由基的清除能力结果相似，4个品种叶片不同溶剂提取物对ABTS+自由基的清除能力由大到小依次表现为：50%乙醇提取物>70%乙醇提取物>无水乙醇提取物>水提取物。所有样品中，以沙巴嫩叶50%乙醇提取物效果最佳(EC50=0.142 g/L)，沙巴嫩叶70%乙醇提取物次之(EC50=0.150 g/L)，四季早生老叶水提取物效果最差(EC50=16.943 g/L)。
表6 4种嘉宝果叶片不同溶剂提取物清除ABTS+自由基效果的比较Table 6 Comparison of scavenging effects on ABTS+ radical of leaf extracts of different solvents from 4 Jaboticaba cultivars
表6(续) Contined table 6
2.6 总多酚、总黄酮含量与抗氧化活性的相关性
4个品种嘉宝果叶片提取物总多酚、总黄酮含量与其抗氧化活性的相关性见表7。表7表明，所有叶片醇提取物总多酚含量与DPPH·、·OH、ABTS+自由基清除能力均呈极显著正相关性(P<0.01)；水提取物总多酚含量仅与ABTS+自由基清除能力呈极显著正相关性(P<0.01)。无水乙醇提取物总黄酮含量与ABTS+、DPPH·自由基清除能力极显著正相关(P<0.01)，与·OH自由基清除能力显著正相关(P<0.05)；50%乙醇提取物总黄酮含量仅与ABTS+自由基清除能力显著正相关(P<0.05)；水提取物总黄酮含量仅与ABTS+、DPPH·自由基清除能力显著正相关(P<0.05)。
表7 嘉宝果叶片提取物中总多酚和总黄酮含量与抗氧化活性的相关性分析Table 7 Correlation between total polyphenols and total flavonoids and the antioxidant activities of extracts of Jaboticabal leaves
注：*表示相关性显著(P<0.05)； **表示相关性极显著(P<0.01)。
Note: * Means significant correlation at 0.05 level (P<0.05);** Means significant correlation at 0.01 level (P<0.01).
3 讨论与结论
本研究对采自同一农场的4个品种嘉宝果嫩/老叶分别用无水乙醇、70%乙醇、50%乙醇和水提取，共获得32个提取液样品，比较其总多酚、总黄酮含量和抗氧化活性。结果表明，同一品种嫩叶的总多酚、总黄酮含量均高于老叶。潘剑用等[21]在研究桑叶抗氧化活性时发现，桑树上部叶的功能成分含量如多酚、黄酮和多糖等均比中部叶和下部叶高。陈明等[22]检测了6个品种费约果叶片甲醇提取物的多酚含量时，也得出嫩叶的多酚含量均较成熟叶高的结论，但总黄酮含量在成熟叶中较高，这与本研究稍有不同。植物在幼嫩期具有更高总多酚含量的特征在蓝莓[23]、沙枣[24]、草莓[25]等植物中也有发现。值得一提的是，Alezandro等[26]按照嘉宝果的果皮颜色将果实分为绿色期、淡粉期、红色期、深红期、黑紫期等5个成熟期，测定5个成熟期果实的总多酚含量、DPPH·自由基清除能力和亚铁还原能力，结果发现绿色期的果实总多酚含量、DPPH·自由基清除能力和亚铁还原能力最高，黑紫期的果实最低，结合本研究结果可知，嘉宝果叶片和果实成熟度对多酚含量都有明显影响，幼嫩时期的果实和叶片多酚含量较高。罗娅等[27]研究发现，植物的基因型显著影响不同品种费约果叶片的总多酚和原花青素含量；不同品种的油橄榄叶总多酚含量存在差异[28]。因此笔者推测，嘉宝果不同品种间总多酚与总黄酮的含量差异，可能是受遗传因素影响所致。
不同溶剂对提取物化学组成及含量有很大影响[29-31]，如鹿衔草的甲醇提取物总多酚含量高于氯仿和石油醚提取物[32]，连翘叶乙醇提取物总多酚含量高于乙酸乙酯和水提取物[33]。有报道指出，75%乙醇具有较强的破壁能力，可以有效穿透植物细胞壁，有助于充分提取植物有效成分[34]。本研究中，各样品70%乙醇提取物中总多酚含量均高于其他溶剂提取物。本研究发现，4个品种嘉宝果叶片不同溶剂提取物对DPPH·、ABTS+清除能力低于抗坏血酸，而对·OH的清除能力则远高于抗坏血酸，其中以50%和70%乙醇提取物的抗氧化性最佳，水提取物最差；50%和70%乙醇提取物总多酚、总黄酮含量明显高于无水乙醇和水提取物，表明50%～70%乙醇溶液能更好地溶出嘉宝果叶片中的多酚和黄酮类物质。
本研究相关性分析结果表明，各嘉宝果品种醇提取物对DPPH·、ABTS+、·OH 等3种自由基的清除能力与总多酚含量均呈极显著相关性，总多酚含量高则对自由基的半数清除浓度低，显示出更高的抗氧化能力。有关红薯叶的研究表明，不同溶剂红薯叶提取物以乙酸乙酯层总多酚含量最高，其对DPPH·、ABTS+自由基的清除能力以及对ORAC氧自由基的吸收能力均大于其他溶剂提取物[35]；蓝莓各部位对·OH自由基的清除能力和铁还原能力随总多酚质量浓度的提高而升高，表现出正相关性[23]；马利华等[36]研究显示，相比水、三氯甲烷及乙酸乙酯3种溶剂，70%乙醇牛蒡皮提取液中总多酚含量最高，对DPPH·、·OH自由基的清除能力也最强。上述研究结果均与本研究类似。本研究发现，无水乙醇提取物对DPPH·、ABTS+和·OH 3种自由基的清除能力与总黄酮含量显著相关；50%乙醇提取物仅对ABTS+自由基清除能力与总黄酮含量显著相关；水提取物对DPPH·、ABTS+2种自由基的清除能力与总黄酮含量显著相关；而70%乙醇提取物的自由基清除能力与总黄酮含量无明显相关性。有研究发现，薄荷不同溶剂提取物清除DPPH·、ABTS+和铁离子还原能力与黄酮含量相关性较小[37]，这与本研究结果类似。铁皮石斛提取物对DPPH·、ABTS+的清除能力与总黄酮含量相关性较强，对·OH的清除能力则与总多酚含量显著相关[38]。说明总多酚和总黄酮含量均能够影响提取物的抗氧化活性，而嘉宝果叶片提取物抗氧化活性的差异主要来源于各提取物中总多酚含量的差异，总黄酮含量对抗氧化活性影响较小。
本研究中，沙巴嫩叶4种溶剂提取液的抗氧化活性以及总多酚含量均优于其他品种，总多酚含量高达273.70 mg/g，约占已报道的嘉宝果果皮总多酚含量(556.3 g/kg)的50%[12]，与青茶中的盛华茗茶茶总多酚含量相当(277.47 g/kg)，而高于其他10种茶叶茶总多酚含量，如金骏眉、铁观音、大红袍等[39]。
综上，本研究不同品种嘉宝果叶片总多酚和总黄酮含量存在明显差异；同一品种嫩叶的抗氧化性以及总多酚、总黄酮含量高于老叶；50%和70%乙醇提取物的总多酚、总黄酮含量及抗氧化活性优于无水乙醇和水提取物；醇提取物抗氧化性与总多酚含量极显著正相关；所有样品中，沙巴嫩叶的总多酚含量和抗氧化能力最优。但提取物中发挥抗氧化活性的主要成分以及不同成分之间是否存在协同作用，有待进一步研究。
