李 哲，吴 迪，张秀芳，赵兴敏，周 野，车 驰，李明堂

(吉林农业大学 资源与环境学院，吉林省商品粮基地土壤资源可持续利用重点实验室，吉林 长春 130118)

1 材料与方法

1.1 供试菌株和土样

供试菌株：本课题组分离获得的1株可通过产生脲酶来分解培养体系中的尿素产生碳酸根离子和铵根离子的菌株LAX2，系统发育分析表明，该菌株与氧化木糖无色杆菌(Achromobacterxylosoxidansstrain SR50-12)的遗传距离最近。菌株LAX2可产活性高达140 U/mL的脲酶，发酵液pH值可达到9.06。

供试土样：从吉林省受Cd污染较为严重的地区采集土样带回实验室，风干，过孔径2 mm筛，用于LAX2菌株对Cd的固定化作用研究。供试土壤的pH为6.67，总Cd和有效态Cd的含量分别为0.86和0.28 mg/kg。

1.2 主要培养基

牛肉膏蛋白胨培养基(LB培养基)：蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH=7.0～7.1，121 ℃高压灭菌25 min, 加入20 g/L的琼脂粉制备成固体培养基。

含尿素培养基：蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蒸馏水定容至900 mL，121 ℃高压灭菌25 min，待培养基恢复到室温时，加入300 g/L的尿素溶液(0.45 μm滤膜)100 mL，调节pH为7.0～7.1。

1.3 LAX2菌悬液的制备与发酵液及其组分的获取

菌悬液的制备和培养条件：挑取在牛肉膏蛋白胨固体培养基上长势旺盛的单个LAX2菌落，接种于LB培养基中，于25 ℃、160 r/min 活化24 h后，在4 ℃下以4 000 r/min离心10 min，收集菌体细胞，接种于LB培养基中，于25 ℃、160 r/min 富集培养24 h后，将培养物于4 000 r/min离心10 min，将所获得的菌体细胞沉淀用无菌水洗2～3次后，重新悬浮于无菌水，制备成600 nm处吸光值(D600 nm)为0.4左右的菌悬液(每mL约含2×107个菌体细胞)。

发酵液的制备及各组分的获取：将上述制得的菌悬液接种到含尿素的培养基中，于25 ℃、160 r/min下培养24 h，即获得发酵液。将发酵液于8 000 r/min离心5 min，取上清液为无菌发酵液，将离心沉淀的菌体细胞重新悬浮于与发酵液体积相同的无菌水中，即得菌体细胞。

1.4 菌株LAX2对Cd的耐受性

将活化培养的LAX2菌体细胞分别接种于Cd2+质量浓度为0，5，10，15，20，25，30，35和40 mg/L的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在25 ℃、160 r/min的条件下培养24 h，测定其D600 nm值。

1.5 菌株LAX2对Cd的碳酸盐矿化作用

1.5.1 矿化产物特征分析 取1.3节制备的发酵液200 mL，加入0.1 mol/L的CdCl2溶液10 mL，室温下放置12 h，过滤后将所得沉淀在50 ℃烘箱中烘干，然后分别进行扫描电镜、X-射线衍射(XRD)、红外光谱和能谱分析。用镊子取一小块烘干的矿化产物，将其粘附于圆柱形台子上，表面镀金后，将样品放入仪器内，放大20 000倍，寻找清晰晶体并拍照，随后进行能谱元素分析。将矿化产物用玛瑙研钵研磨，过孔径为0.048 mm筛后将样品放入圆形凹槽内，压实，在2θ为3°～80°条件下进行X-射线衍射分析。将矿化产物样品与KBr按照质量比为1∶150混合，放入玛瑙研钵中研磨，取适量研磨后的样品放入压片机进行压片，然后采用傅里叶红外光谱仪在波数为4 000～500 cm-1对样品进行表面官能团定性分析。

1.5.2 发酵液不同组分对Cd2+的去除作用 将按1.3节获得的发酵液、无菌发酵液、菌体细胞分别用于对Cd2+的去除研究。具体试验方法如下：向40 mL 质量浓度为40 mg/L的CdCl2溶液中分别加入40 mL的发酵液、无菌发酵液和菌体细胞，在室温下静置1.5 h后过0.45 μm滤膜，用微波等离子体原子发射光谱仪测定滤液中Cd2+质量浓度，并计算Cd2+的去除率:Cd2+去除率=(去除前Cd2+质量浓度-去除后Cd2+质量浓度)/去除前Cd2+质量浓度×100%。

1.5.3 环境条件对矿化产物稳定性的影响 分别取1.3节制备的发酵液、无菌发酵液和菌体细胞5 mL，均匀加入到装有10 g土的培养皿内，并以等体积无菌水作为对照，在25 ℃的恒温培养箱中培养，每2 d向培养皿内喷洒3 mL无菌水，保持土壤湿润。将培养10 d后的土壤样品分别进行正常、淹水、酸化和反复冻融处理。正常培养处理方式为：将培养过后的土壤放在室温下，加蒸馏水润湿，保证其湿度，培养20 d后采集土壤样品。淹水处理方法为：加入过量的蒸馏水，使其没过土壤1.5 cm，放于25 ℃恒温箱中培养，每天补充水分以保证整个试验过程中淹水状态一致，培养20 d后采集土壤样品。酸化处理方法为：每天向土样中加入2 mL 浓度为0.02 mol/L的硝酸溶液，酸化至土壤pH为4.52，然后再培养20 d，采集土壤样品用于测定。反复冻融方法为：向土样中加入少量无菌水润湿，放于4 ℃冰箱2 h后取出，再放于-20 ℃冰箱冷冻12 h，然后取出再次放入4 ℃冰箱中2 h后取出，放入25 ℃恒温培养箱中培养48 h，再进行冷冻、解冻和培养，如此反复冻融培养20次后采集样品。所有采集的样品自然风干，过孔径0.2 mm筛后测定有效态Cd和总Cd含量，计算有效态Cd占总Cd的比例。

1.5.4 水稻盆栽试验 配制CdCl2溶液，均匀加入到供试土壤中，使得土壤中总Cd含量为3.0 mg/kg，在室温下稳定20 d后，用于水稻盆栽试验。将土壤样品加入到上口直径20 cm、下口直径15 cm、深度20 cm的花盆中，每盆中装土8 kg，之后分别加入2 L发酵液、无菌发酵液和菌体细胞，以添加2 L无菌水处理作为对照组，每处理重复3次。每盆施加100 g硝酸钾复合肥料后于室外保持淹水状态，待土壤紧实后，选取长势良好且形态一致的吉梗88水稻秧苗移栽到花盆中，每盆5棵，按照常规方法进行统一的水分管理，在室外生长120 d后收获，分别采集水稻根系、茎叶和籽粒，测定其总Cd含量；同时采集植株根部土壤，用于测定有效态Cd含量[16]。

1.5.5 总Cd和有效态Cd含量测定 采用王水-高氯酸微波消解法对1.5.3和1.5.4节样品进行预处理，过0.45 μm滤膜后测定Cd含量。采用DPTA浸提剂提取1.5.3和1.5.4节土壤样品中有效态Cd，过0.45 μm滤膜后测定有效态Cd含量[17]。以上总Cd含量和有效态Cd含量都利用安捷伦 MP-AES 4100型微波等离子体原子发射光谱仪进行测定，并通过重复测定以及使用国家环保部土壤质量控制样品(QCM-TW001)和大米粉中镉成分分析标准物质(GBW08511)进行全程质量控制。

1.6 数据统计与分析

试验数据利用Excel 2013进行处理，以“平均值±标准差”表示。用DPS进行差异显著性分析，用Jade5软件对矿化产物进行晶形分析。

2 结果与分析

2.1 菌株LAX2对Cd2+的耐受性研究

在Cd2+质量浓度为0，5，10，15，20，25，30，35，40 mg/L的牛肉膏蛋白胨培养基中接入菌株LAX2，培养24 h后测定D600 nm，结果如图1所示。从图1可以看出，当Cd2+质量浓度为35 mg/L时，菌株LAX2生长速度与0 mg/L时相比显著下降，此时菌株的长势良好，但当Cd2+质量浓度增加至40 mg/L时，菌株的生长受到显著抑制，生长缓慢且长势明显减弱(P<0.05)。

2.2 Cd的碳酸盐矿化产物特征

菌株LAX2矿化固结Cd的产物特征如图2所示。从图2-A中可以看出，生物矿化产物呈小颗粒团聚结构，形状相对整齐；图2-B表明，产物的主要衍射峰出现在23.485°,30.275°,36.415°,43.804°，49.908°和58.237°，与标准PDF卡片(42-1342号卡片)中的012、104、110、202、116、122号波峰的晶面相吻合，其分子式为CdCO3；红外光谱图(图2-C)表明，此产物表面带有C-O基团；而能谱图(图2-D)表明，产物中含有Cd、C和O 3种元素。综合上述特征，可以推断菌株LAX2可通过碳酸盐矿化作用将Cd矿化为呈小颗粒团聚状体的CdCO3晶体。

图柱上标不同小写字母表示差异显著。图3同Different lowercase letters indicate significant differences.The same for Figure 3图1 菌株LAX2对Cd2+的耐受性Fig.1 Tolerance of strain LAX2 against Cd2+

A.扫描电镜图;B.XRD图;C.红外光谱图;D.能谱图A.Scanning electron microscopy picture;B.XRD picture;C.Infrared spectrum;D.The energy spectrum图2 菌株LAX2矿化固结Cd的产物特征分析 Fig.2 Characteristics of bio-mineralization products of Cd

2.3 发酵液不同组分对Cd2+的去除作用

发酵液、无菌发酵液和菌体细胞对Cd2+的去除效果如图3所示。

图3 菌株LAX2发酵液不同组分对Cd2+的去除作用Fig.3 Removal of Cd2+ by different components of strain LAX2 fermentation liquid

从图3可以看出，菌体细胞吸附作用对Cd2+的去除效果最好，去除率(92.2%)显著高于无菌发酵液和发酵液(P<0.05)；发酵液生物矿化作用对Cd2+去除效果次之，去除率(89.1%)显著高于无菌发酵液(P<0.05)；去除效果最差的为无菌发酵液，去除率为78.2%。综上，菌株LAX2的菌体细胞对Cd具有非常高的吸附能力，从而为生物矿化作用提供了基础条件，并且证明了这种生物矿化作用兼具细胞吸附和化学沉淀两种过程。

2.4 环境条件对菌株LAX2矿化固结有效态Cd的影响

将经过发酵液、无菌发酵液和菌体细胞培养过的稻田土壤分别进行正常培养、淹水、酸化和反复冻融4种处理后，土壤中有效态Cd占Cd总量的比例如图4所示。从图4可以看出，经发酵液培养过的土壤在正常培养、酸化、淹水或是反复冻融后，其有效态Cd含量占Cd总量的比例均无明显变化(P>0.05)；而经无菌发酵液和菌体细胞处理的土壤在酸化、淹水、反复冻融之后，土壤中有效态Cd占总Cd的比例较正常培养处理分别增加4.3%，6.9%，12.9%和 6.3%，12.3%，17.8%(P<0.05)。以上结果表明，LAX2发酵液矿化后的产物在短期内对淹水、酸化、反复冻融都有很强的抗性，生物矿化作用形成的矿化产物性质比较稳定，对土壤中有效态Cd的固定具有较强的持久力；而无菌发酵液和菌体细胞沉淀后的产物不稳定，容易受到环境的影响导致Cd重新释放到土壤中。

同一发酵液组分不同环境条件处理相比，柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant difference for same fermentation liquid among different conditions (P<0.05)图4 环境条件对菌株LAX2矿化固结有效态Cd的影响Fig.4 Effects of environmental conditions on bio-mineralization product of Cd by LAX2

2.5 菌珠LAX2对Cd污染稻田土壤的修复作用

2.5.1 水稻各组织总Cd含量 将采集回来的盆栽水稻的各组织经消解处理后测定总Cd含量，结果如图5所示。从图5可以看出，与对照相比，经发酵液、无菌发酵液和菌体细胞处理过的土壤种植的水稻，其根部总Cd含量分别极显著下降了35.3%，19.4%和12.5%(P<0.01)，茎叶总Cd含量分别极显著降低了26.7%，15.6%和8.4%(P<0.01)，水稻籽粒中的总Cd含量分别极显著降低了28.7%，16.4%和7.5%(P<0.01)。以上结果表明，生物矿化作用对土壤中有效态Cd的固定效果较好，能够明显减少水稻对Cd的吸收和积累，从而降低稻田土壤Cd污染所带来的人体健康风险。

水稻同一部位不同发酵液组分处理相比，柱上标不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下图同Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05),while capital letters indicate extremely significant difference (P<0.01) for same rice parts among different broth components. The same below.图5 菌株LAX2发酵液不同组分对水稻根、茎叶、籽粒中Cd含量的影响Fig.5 Effect of different components of strain LAX2 fermentation liquid on Cd contents in rice root,stem and leaf,and grain

2.5.2 土壤中有效态Cd含量 菌株LAX2发酵液不同成分对稻田土壤中有效态Cd含量的影响如图6所示。由图6可知，与对照相比，经发酵液、无菌发酵液和菌体细胞修复后的土壤有效态Cd含量分别极显著下降了56.9%，34.5%和21.0%(P<0.01)，表明菌株LAX2发酵液不同组分对有效态Cd均有一定的固定化作用，其中以发酵液的作用最强，表明菌株LAX2在Cd污染稻田土壤修复方面具有潜在的应用价值。

图6 菌株LAX2发酵液不同组分对稻田土壤中有效态Cd含量的影响Fig.6 Effect of different components of strain LAX2 fermentation liquid on the effective Cd content in paddy soil

3 讨 论

碳酸盐矿化菌是一类可以通过自身的生命活动与周围环境介质之间发生酶化作用，从而使某些介质逐渐矿化形成一种碳酸盐胶结物质，经过漫长的沉积作用最终形成坚硬岩石的微生物[18]。目前一些研究表明，环境中存在的这类微生物如巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等，可以通过分泌脲酶分解尿素，释放出碳酸根来矿化固结环境中的重金属[19]。利用微生物的生长和代谢活动固定重金属的相关研究表明，微生物活性在固定重金属过程中起着至关重要的作用，研究中为了避免因有效态重金属浓度过高而致使微生物死亡，一般都选用对重金属抗性较强的菌株。本研究结果表明，氧化木糖无色杆菌LAX2对Cd2+的耐受能力较强，其耐受Cd2+的质量浓度最高可达到35 mg/L，由于土壤对微生物的毒性作用主要是由土壤中有效态重金属产生的，而稻田土壤中有效态重金属，尤其是有效态Cd含量一般不会超过1 mg/kg[20]，因此菌株LAX2在修复Cd污染稻田土壤方面具有明显优势。菌株LAX2的发酵液可将重金属离子Cd2+矿化生成小颗粒团聚结构的CdCO3，可去除溶液中78.2%的Cd2+。成亮等[12]研究了一株芽孢杆菌对Cd的生物矿化作用，表明该菌的矿化产物也为小颗粒团聚状的CdCO3，但该菌对Cd2+的耐受质量浓度仅为0.595 mg/L。赵越等[21]研究了5株碳酸盐矿化菌对Cd的去除作用，这5株菌在LB液体培养基中对Cd2+的最高耐受质量浓度可达250 mg/L，但该研究并未探讨菌株的种类，也没有对矿化产物结构特征进行分析。菌株LAX2发酵液的不同组分对Cd2+的去除效果不同，表明生物矿化作用、菌细胞吸附作用以及化学沉淀作用之间的机制不同，生物矿化作用首先是菌细胞吸附重金属离子形成晶核，然后与代谢产物中的阴离子相结合，聚集在晶核上，在小分子有机代谢产物的调控下，逐渐聚合为粒径大、性质稳定的团聚结构的矿物[22]，因此生物矿化作用是细胞吸附和化学沉淀的叠加。土壤中有效态重金属的固定往往受到环境条件，如pH值、氧化还原条件等的影响[23-24]，一些固定作用和微生物吸附作用等还受到微生物死亡的影响[25-26]。本研究结果表明，菌株LAX2发酵液的生物矿化作用生成的产物性质稳定，在短期内对淹水、酸化和反复冻融都有较强的抗性，即固定的有效态Cd不会因环境条件的改变而活化，但生物矿化的长期效应仍需要进一步研究。目前关于Cd的生物矿化实际应用研究明显不足，成亮等[12]研究了芽孢杆菌对小麦土壤Cd的修复效果，表明该菌株可将土壤中有效态Cd浓度降低91%以上，进而使小麦Cd含量下降80%以上，因此利用碳酸盐矿化菌修复Cd污染土壤是可行的。本试验研究了菌株LAX2对Cd污染稻田土壤的修复效果，结果表明，菌株LAX2可通过生物矿化作用明显降低水稻根系、茎叶和籽粒中的Cd含量，同时对土壤中有效态Cd含量也有明显的降低作用，但关于菌株LAX2通过碳酸盐矿化作用固定土壤中Cd的长效性以及如何进一步提高有效态Cd的固定率还有待于进一步研究。

4 结 论

1)菌株LAX2对Cd2+的耐受质量浓度为35 mg/L，可通过生物成矿作用将Cd2+矿化固结为呈小颗粒团聚状的CdCO3晶体。

2)菌株LAX2不同组分对Cd2+去除率的大小顺序为菌体细胞>发酵液>无菌发酵液；发酵液矿化后的产物对短期内的土壤淹水、酸化和反复冻融有较强的抗性，不易活化。

3)修复试验结果表明，菌株LAX2发酵液的生物矿化作用对Cd的固定效果最好，与对照相比，可使得水稻根部、茎叶和籽粒中Cd含量分别下降35.3%，26.7%和28.7%，土壤有效态Cd含量下降56.9%。因此菌株LAX2可应用于Cd污染稻田土壤的修复。