刘国阳，华 涛，乔绪稳，唐 波，常 晨，侯继波，李锦春，张道华

(1 安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036；2 江苏省农业科学院/国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京 210014)

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)病和猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)病是目前危害世界养猪业的重大疫病。PPV是一种高度稳定且持久感染的自主型病毒，可导致胚胎的死亡、吸收、木乃伊胎、死产、母猪分娩周期延长、不育等一系列典型的繁殖障碍疾病[1-3]。PCV是目前发现的最小的动物病毒，在自然界中分布十分广泛，包括PCV1和PCV2 2种血清型，其中PCV1无致病性，而PCV2对猪具有很强的感染能力，不同品种、日龄和性别的猪群均可感染[4]。PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原，其主要侵害猪体的免疫系统，降低被感染猪的免疫力，使猪体产生免疫抑制[5-7]，但其单独感染并不能引发严重的临床症状，只有与其他病原混合感染才会表现出不同的临床症状。多病原混合、协同感染是目前猪群中PCV相关疾病流行的主要模式，也是此类疾病防控的主要难点[8-10]。临床上PPV和PCV2的混合感染非常普遍且症状严重，两者混合感染后PPV能明显促进PCV2增殖，加重PMWS的病理损伤及PCV2相关疾病的临床症状，这在实验室及临床上均已得到证实[11-12]。

VP2蛋白是PPV病毒衣壳蛋白的主要成分，约占衣壳蛋白的90%，有9个线性B细胞抗原表位，能够诱发机体产生抗PPV病毒的特异性中和抗体[13]，同时VP2基因也决定着PPV病毒的血凝活性，影响病毒的宿主范围和进化关系。PPV不同毒株之间的差异一般表现为VP2基因的不同，其编码产物VP2蛋白对病毒感染至关重要，有研究表明，用VP2蛋白的抗体封闭PPV易感宿主，病毒将丧失对易感细胞的侵染性[14]。

PCV2 ORF2基因编码病毒的结构蛋白Cap，Cap蛋白位于细胞核内，其N端的前41个氨基酸高度保守并富含精氨酸及碱性氨基酸，是其核定位信号区域(NLS)，这段序列诱导表达过程中会大量消耗大肠杆菌中编码精氨酸的tRNA，影响宿主菌繁殖，从而限制蛋白合成速度，甚至会抑制蛋白质的合成，导致蛋白合成的早期终止[15]。Liu等[16]用大肠杆菌表达PCV2 ORF2全基因，但表达量较低，甚至检测不到Cap蛋白。Liu等[17]对PCV2结构蛋白B表位的分析表明，该蛋白含有特异性表位抗原，具有很强的免疫原性，并且能够诱导机体产生特异性中和抗体。

疫苗免疫是预防PPV和PCV2相关疾病的主要手段，VP2蛋白和Cap蛋白均具有病毒的主要抗原表位，是研制病毒基因工程疫苗的重要靶标。为了有效地预防这2种疾病，国内外许多研究人员进行了相关疫苗的研究，但成功上市的有关PPV和PCV2的疫苗仍全部为单苗，关于PPV和PCV2二联疫苗的报道非常少见，大肠杆菌表达的二联亚单位疫苗更是尚未见报道。本研究利用大肠杆菌表达系统表达出可溶性的PCV2 Cap蛋白和PPV VP2蛋白，并将2种蛋白联合乳化制备二联亚单位疫苗，通过皮下注射途径免疫小鼠，检测其细胞免疫和体液免疫应答水平，以期为后期PCV2和PPV二联亚单位疫苗的研究开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

PCV2 NJ株和PPV NJ株均由国家兽用生物制品工程技术研究中心分离鉴定和保存。PCV2利用PK-15a细胞增殖，滴度(TCID50)可达10-6.5mL-1；PPV NJ株利用ST细胞增殖，TCID50可达10-7.0mL-1。pET-32a表达载体、原核表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)及小鼠PPV和PCV2阳性、阴性血清，均由国家兽用生物制品工程技术研究中心动物疫苗产品研究室制备保存。大肠杆菌DH5α感受态细胞、DAN提取试剂盒、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、PCR试剂、pMD18-T载体及异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和SYBR荧光染料，均购于TaKaRa公司；PVDF膜，购自MILLIPORE公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，均购自Axy GEN公司；猪抗PCV2多克隆抗体，购自美国VMRD公司；HRP标记羊抗鼠抗体和MTT，生兴公司产品；FITC标记葡萄球菌A蛋白和DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司产品；免疫佐剂ISA201，法国SEPPIC公司生产；PCV2抗体检测试剂盒，上海酶联生物科技有限公司产品。其余试剂均为国产或进口分析纯级试剂。

4～5周龄ICR小鼠，购自扬州大学比较医学中心。

1.2 目的基因的合成与克隆

1.2.1 目的基因的合成 获取GenBank中的PCV2 ORF2基因和PPVVP2基因全序列对应的氨基酸序列，设计截去NLS信号肽序列的Cap蛋白氨基酸序列和VP2蛋白氨基酸序列，按照大肠杆菌偏嗜密码子，优化合成对应的基因序列，在2段基因序列两端均分别添加BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点。基因序列由南京金斯瑞生物科技公司合成后，克隆到pUC57载体上。

1.2.2 重组质粒的构建 通过BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切，将基因片段Cap和VP2从pUC57上切下，克隆到表达载体pET-32a上，构建重组表达质粒pET32a-Cap和pET32a-VP2，并进行BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切鉴定。

1.3 重组质粒的表达与鉴定

1.3.1 重组质粒的表达 将酶切鉴定正确的重组质粒pET32a-Cap和pET32a-VP2分别转化原核表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于氨苄青霉素(Amp)抗性的LB平板，挑取单菌落，得到重组菌pET32a-Cap/BL21和pET32a-VP2/BL21。将空质粒pET-32a按照相同的方法转化感受态大肠杆菌BL21，得到对照菌株pET-32a/BL21。挑取重组菌pET32a-Cap/BL21和pET32a-VP2/BL21单菌落，接种于5 mL Amp抗性的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜后作为母液。次日，将母液按体积比1∶70转接于氨苄抗性的新LB液体培养基中，37 ℃下220 r/min振荡培养1.5～2 h， 使菌液在600 nm处的吸光值(D600 nm)达0.8～1.0。向pET32a-Cap/BL21菌液加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG，16 ℃诱导36 h；向pET32a-VP2/BL21菌液加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，16 ℃诱导24 h。收获2种菌液，备用。

1.3.2 重组蛋白的可溶性分析 取10 mL上述诱导的菌液，4 ℃下10 000 r/min离心10 min，收集菌体，用10 mL PBS缓冲液(pH 7.2)重悬，于冰水浴中超声波破碎细菌，取样(全菌对照)，然后4 ℃下12 000 r/min离心10 min，分别收集上清液和沉淀，沉淀用10 mL PBS缓冲液重悬。取全菌、BL21空菌、上清液和沉淀,加入5×Loading buffer，100 ℃煮沸制备蛋白电泳样品，采用SDS-PAGE方法检测重组蛋白的可溶性。

1.3.3 重组蛋白的Western-blotting鉴定 将SDS-PAGE蛋白电泳分离的蛋白条带电转到PVDF转移膜上，用50 g/L的脱脂奶粉于37 ℃封闭孵育1 h，PBST洗涤3次，加3 000倍稀释的小鼠阳性血清，4 ℃孵育过夜，PBST缓冲液充分洗涤5次(5 min/次)，加5 000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h，PBST缓冲液充分洗涤5次(5 min/次)；按照DAB显色试剂盒说明书显色。

1.4 目的蛋白的纯化与定量

大量表达Cap和VP2蛋白，超声波破碎(400 W，工作5 s，间隔5 s，重复25次至菌体溶液变清澈)后，利用GEM颗粒纯化法[18]纯化Cap蛋白，采用饱和硫酸铵沉淀法[19]纯化VP2蛋白。取纯化后的样品，与1.3.2节样品一起进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。利用商品化BCA试剂盒对蛋白进行定量。

1.5 疫苗的制备

取纯化的Cap和VP2蛋白适当稀释，按照一定的体积比配制不同的疫苗：(1) Cap和VP2蛋白单苗：V(ISA201佐剂)∶V(抗原蛋白)=1∶1，Cap和VP2抗原蛋白最终的质量浓度均为250 μg/mL；(2)Cap和VP2蛋白二联亚单位疫苗：V(ISA201佐剂)∶V(Cap蛋白)∶V(VP2蛋白)=2∶1∶1，Cap和VP2抗原蛋白终质量浓度均为250 μg/mL；(3)大肠杆菌BL21对照：V(ISA201佐剂)∶V(大肠杆菌BL21空菌)=1∶1；(4)PBS空白对照：V(ISA201佐剂)∶V(PBS)=1∶1。

1.6 重组蛋白的免疫特性研究

取50只6～8周龄雌性清洁级ICR小鼠，随机分为5组，每组10只。对小鼠进行首次免疫，其中第1～3组分别为Cap蛋白单苗组、VP2蛋白单苗组、Cap和VP2蛋白二联亚单位疫苗组，小鼠颈、背部皮下多点注射相应的疫苗0.2 mL/只；第4组和第5组分别为大肠杆菌BL21对照组和PBS空白对照组，小鼠分别注射相应的液体，注射途径、剂量同上。首次免疫后21 d采用眼眶采血法采集小鼠血液，分离血清，同时对小鼠进行二次免疫(免疫方法和剂量同首次免疫)，42 d采集血清(方法同前)，2次所获血清用于PCV2 ELISA 抗体、PPV HI抗体和中和抗体水平检测。同时，42 d时每组剖杀一半小鼠，无菌取脾脏，用于淋巴细胞增殖试验和细胞因子检测。56 d时采集小鼠血清(方法同前)用于PCV2 ELISA 抗体、PPV HI抗体和中和抗体水平检测，并取PCV2 NJ株和PPV NJ株病毒液作适当稀释得混合病毒液(病毒含量均为106mL-1)，腹腔接种各组剩余的5只小鼠，接种体积为0.5 mL/只，攻毒后21 d剖杀小鼠，无菌摘取脾脏，用于PCV2和PPV病毒含量测定。所有动物实验均在江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心实验动物房进行。

1.6.1 PCV2 ELISA抗体和PPV HI抗体效价的检测 PCV2 ELISA抗体检测：使用上海酶联生物科技有限公司PCV2间接ELISA试剂盒检测血清抗体，2倍倍比稀释小鼠血清，以检测孔呈阴性时的血清最低稀释度的倒数作为血清的抗体效价。PPV HI抗体检测：参照“猪细小病毒病灭活疫苗(NJ株)质量标准”中的血清HI抗体检测方法，以能够抑制50%豚鼠红细胞凝集的血清最高稀释倍数的对数(以2为底)为小鼠血清PPV HI抗体效价。

1.6.2 免疫血清中和抗体效价的测定 采用固定病毒稀释血清的方法对免疫小鼠血清进行中和试验，以能够减少50%特异性荧光灶的血清最低稀释倍数作为待检血清的中和抗体滴度。将待检小鼠血清置于56 ℃灭活30 min，用含体积分数2%小牛血清的DMEM培养基2倍倍比稀释已灭活血清，取不同稀释度的血清与病毒含量为103mL-1的病毒液等体积混合，37 ℃下中和感作2 h，接种已铺满单层细胞(PPV病毒采用ST细胞，PCV2病毒采用PK-15a细胞)的96孔板中(接种量200 μL/孔)，每个稀释度接种3个重复孔，同时设置阳性血清对照、阴性血清对照、病毒对照(PPV或PCV2)和健康细胞(ST细胞或PK-15a细胞)对照。将细胞培养板置于37 ℃、体积分数5% CO2恒温培养箱中培养72 h,采用间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence assay,IFA)检测各孔的感染情况，根据Reed-Muench法[20]计算血清中和抗体效价。

1.6.3 淋巴细胞增殖试验 取上述无菌采集的小鼠脾脏，用淋巴细胞分离液分离脾脏淋巴细胞，以含体积分数10% 新生牛血清的RPMI-1640完全培养液调整细胞密度约为5×106mL-1，铺96孔板(100 μL/孔)，每只小鼠样品铺12个孔，用PPV和PCV2预混病毒液(病毒最终含量均为5×106mL-1)作为试验组，以刀豆蛋白ConA(终质量浓度5 μg/mL)作为刺激抗原的阳性对照组(判断实验是否成立)，以及营养液处理的营养液对照组，每组设4个重复。各组细胞置37 ℃、体积分数5% CO2恒温培养箱中培养60 h，每孔加入25 μL MTT(终质量浓度5 mg/mL)继续培养4 h后，3 500 r/min离心5 min，弃上清，每孔加入100 μL DMSO，振荡溶解紫色结晶，570 nm处测定吸光值(D570 nm)，取4个重复孔的平均D570 nm值计算刺激指数(SI)：SI=试验组D570 nm/营养液对照组D570 nm。以SI作为判断淋巴细胞增殖程度的参数。

1.6.4 细胞因子mRNA水平的检测 无菌分离小鼠脾脏淋巴细胞(方法同1.6.3节)，铺24孔板，按感染复数为1∶1加入淋巴细胞和PPV、PCV2预混病毒液，1 mL/孔，置37 ℃、体积分数5% CO2恒温培养箱中培养3 d，3 500 r/min离心5 min，弃上清，每孔加入500 μL Trizol振荡裂解细胞，提取RNA，采用一步反转试剂盒反转录获取cDNA。

根据Genbank中的白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因相关序列(Genbank登录号分别为：M29854、L20001、X53085和X54859)设计引物(表1)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。参照王永帅等[21]的研究，以β-actin为内参基因(引物见表1)，利用荧光定量PCR法检IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的mRNA表达水平。

表1 用于PCR扩增的引物序列Table 1 Primer sequences for PCR in this experiment

1.6.5 Real-time PCR定量检测PPV和PCV2 称取相同质量的小鼠脾脏，按照DNA提取试剂盒说明书分别提取PPV和PCV2病毒DNA，采用Real-time PCR法检测脾脏中2种病毒的含量。试验在罗氏荧光定量PCR仪上进行，反应条件为:50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环，同时设ddH2O为阴性对照，得到对应的循环阈值(Ct值)，根据标准曲线方程[21]计算0.1 g样品中的PCV2和PPV核酸拷贝数。

1.7 数据统计分析

应用GraphPad PRISM软件对数据进行统计分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pET32a-Cap和pET32a-VP2的鉴定

构建的重组表达质粒pET32a-Cap和pET32a-VP2经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后分别获得了687和1 740 bp的目的片段(图1)，与预期结果一致，表明重组质粒pET32a-Cap和pET32a-VP2构建成功。

M1.DL2000 DNA Marker；1.pET32a-Cap的BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切结果；M2.DL10000 DNA Marker；2.pET32a-VP2的BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切结果M1.DL2000 DNA Marker;1.Digestion product by BamHⅠ and Hind Ⅲ from pET32a-Cap;M2.DL10000 DNA Marker;2.Digestion product by BamHⅠ and Hind Ⅲ from pET32a-VP2图1 pET32a-Cap和pET32a-VP2重组质粒的双酶切鉴定结果Fig.1 Double-enzyme digestion products of recombinant plasmids pET32a-Cap and pET32a-VP2

2.2 Cap和VP2蛋白的表达及纯化

SDS-PAGE分析结果表明，PCV2 Cap重组蛋白主要存在于菌体裂解的上清液中，沉淀中蛋白含量极低(图2-A)；PPV VP2重组蛋白以包涵体和上清液2种形式存在，但以上清液中含量较高(图3-A)。Western-blotting结果显示，Cap和VP2重组蛋白均可以与相应阳性血清反应，分别在27 ku(图2-B)和67 ku(图3-B)处有清晰的特异性条带出现，表明重组蛋白可被特异性的抗体所识别，具有较好的免疫原性。2种重组蛋白纯化后，PCV2 Cap蛋白获得较为单一的条带，PPV VP2蛋白纯度也显著提高，表明2种蛋白的纯化效果良好(图2，3)，纯化后，PCV2 Cap蛋白质量浓度为1 213 μg/mL，PPV VP2蛋白质量浓度为1 025 μg/mL。

2.3 PCV2 ELISA抗体和PPV HI抗体效价的检测

由图4-A可知，首免后21 d，Cap单苗和Cap/VP2二联苗免疫组小鼠血清的PCV2 ELISA抗体效价高于400；免疫后42～56 d，小鼠血清PCV2 ELISA抗体明显上升，42 d时达到800以上，56 d时均超过3 200，二联亚单位疫苗组与Cap蛋白单苗组间无明显差异。大肠杆菌BL21对照组、PBS空白对照组及VP2单苗免疫组PCV2 ELISA抗体检测结果为阴性。

由图4-B可知，首次免疫后21 d，各免疫组PPV HI抗体效价≤5，低于疫苗合格标准(HI抗体效价≥6)；免疫后42 d，Cap/VP2二联苗免疫组和VP2蛋白单苗免疫组抗体水平上升，HI抗体效价均大于6，达到PPV疫苗合格标准，且二联苗与单苗差异不明显；免疫后56 d，HI抗体效价仍保持较高水平(HI抗体效价>6)。大肠杆菌BL21对照组、PBS空白对照组及Cap蛋白单苗组PPV HI抗体检测结果均呈阴性。

M1.CLEARLY蛋白质Marker；1.Cap重组菌裂解沉淀；2.Cap重组蛋白上清液纯化样品；3.Cap重组菌裂解上清液；4.Cap重组菌全菌对照；5.BL21空菌对照；M2.PageRuler蛋白质MarkerM1.CLEARLY protein Marker;1.Sediment for recombinant plasmid pET32a-Cap transformed BL21 after supersonic;2.Supernatant for pET32a-Cap;3.Supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pET32a-Cap transformed BL21;4.Whole bacterium of BL21 transformed with pET32a-Cap;5.Blank control of BL21 transformed with plasmid;M2.PageRuler protein Marker图2 PCV2 Cap重组蛋白的SDS-PAGE (A)及Western blotting (B)分析Fig.2 Analyses of PCV2 Cap recombinant protein by SDS-PAGE(A) and Western blotting(B)

M1.CLEARLY蛋白质Marker；1.VP2重组菌裂解沉淀；2.VP2重组蛋白上清液纯化样品；3.VP2重组菌裂解上清液；4.VP2重组菌全菌对照；5.BL21空菌对照；M2.PageRuler蛋白质MarkerM1.CLEARLY protein Marker;1.Sediment for recombinant plasmid pET32a-VP2 transformed BL21 after supersonic;2.Supernatant for pET32a-VP2;3.Supernatant of supersonic treated recombinant plasmid pET32a-VP2 transformed BL21;4.Whole bacterium of BL21 transformed with pET32a-VP2;5.Blank control of BL21 transformed with plasmid;M2.PageRuler protein Marker图3 PPV VP2重组蛋白的SDS-PAGE (A)及Western blotting (B)分析Fig.3 Analyses of PPV VP2 recombinant protein by SDS-PAGE(A) and Western blotting(B)

图4 免疫后小鼠血清PCV2 ELISA抗体效价(A)和PPV HI抗体效价(B)Fig.4 PCV2 ELISA antibody titers (A) and PPV HI antibody titers (B) in vaccinated mice serum

2.4 PCV2和PPV病毒中和效价的检测

由图5-A可知，与大肠杆菌BL21对照组、PBS空白对照组及VP2单苗组相比，Cap/VP2二联苗免疫组与Cap单苗组小鼠在免疫后21 d可产生中和抗体，效价最高可达16，且组间差异不明显；在免疫后42 d，血清中和效价均在32～38，组间无明显差异；在免疫后56 d，血清中和效价仍保持在34～38，与免疫后42 d结果相比无明显变化，且Cap/VP2二联苗组与Cap单苗组无明显差异。大肠杆菌BL21对照组、PBS空白对照组及VP2蛋白单苗免疫组PCV2中和抗体检测结果均为阴性。

由图5-B可知，Cap/VP2二联苗免疫组与VP2蛋白单苗组小鼠在免疫后21 d可检测到PPV病毒的血清中和抗体；在免疫后42 d血清中和抗体效价较高，均在300～350，组间差异不明显；在免疫后56 d，血清中和抗体无明显上升，与免疫后42 d相当。大肠杆菌BL21对照组、PBS空白对照组及Cap蛋白单苗免疫组PPV中和抗体检测结果均为阴性。

图5 免疫后小鼠血清PCV2(A)和PPV(B)中和抗体效价Fig.5 Anti-PCV2 (A)and anti-PPV (B) neutralization antibody titers in vaccinated mice serum

2.5 淋巴细胞增殖试验结果

由图6可知，与大肠杆菌BL21对照组、PBS空白对照组相比，各试验组小鼠脾淋巴细胞的刺激指数显著升高，其中Cap/VP2二联亚单位疫苗免疫组脾淋巴细胞刺激指数高于2.0，显著高于Cap和VP2蛋白单苗免疫组(P<0.05)，2个单苗组之间脾淋巴细胞刺激指数无显著性差异(P>0.05)。

2.6 小鼠细胞因子mRNA水平的检测结果

由图7可知，利用PPV和PCV2病毒作为刺激原，3个免疫组小鼠IFN-γ和IL-4的mRNA相对表达量显著高于大肠杆菌BL21对照组、PBS空白对照组(P<0.05)；各试验组小鼠IL-10和TNF-α mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。

2.7 小鼠攻毒保护试验结果

由图8可知，3个免疫组小鼠脾脏中的PPV和PCV2含量均显著低于大肠杆菌BL21对照组和PBS空白对照组;3个免疫组间及2个对照组间PPV和PCV2含量差异不显著。Cap/VP2二联亚单位疫苗免疫组小鼠脾脏PCV2含量显著低于单苗免疫组；VP2蛋白单苗免疫组PCV2含量高于Cap蛋白免疫组，但差异不显著。

不同免疫组相比，图柱中标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下图同Different lowercase letters indicate significant difference among immune groups at P<0.05 level.The same below图6 免疫后42 d小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应Fig.6 Lymphocyte proliferative response in mice 42 d after vaccination

图7 免疫后42 d小鼠相关细胞因子mRNA水平的检测Fig.7 Detection of mRNA level of cytokine in mice 42 d after vaccination

图8 免疫攻毒试验小鼠0.1 g脾脏样品中PPV和PCV2含量Fig.8 Virus titers in 0.1 g mice spleen after challenge test

3 讨 论

PMWS是由PCV2病毒引起的一种消耗性疾病，自1991年加拿大首次报道后，该病相继在世界范围内流行，给养猪业造成了巨大的经济损失[22-23]。Allan等[22]研究证实，PPV可增强PCV2对机体的侵染能力，加重PMWS的临床症状，临床调查结果表明，大约15%患有PMWS的仔猪为PPV和PCV2混合感染，这给PMWS的防治工作带来了巨大困难。目前，PMWS的防治措施是疫苗免疫，国内外许多学者都在积极开展相关疫苗研究，市场上以单苗为主，仍未见PPV和PCV2二联疫苗销售，相关研究报道也较为少见。国内外市场上现有的PCV2疫苗主要包括全病毒灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程疫苗、DNA核酸疫苗和嵌合疫苗等[24-26]，PPV疫苗也多为单苗。比较所有相关疫苗的制备工艺和免疫效果，全病毒疫苗存在一定的安全性问题，DNA核酸疫苗和嵌合疫苗生产成本太高，且生产工艺较为复杂。利用大肠杆菌表达系统生产的基因工程疫苗具有生产工艺简单，表达周期较短，生产成本低廉等优点，所以很多学者和公司都希望利用此技术来生产PPV和PCV2疫苗。Zhou等[27]报道，PCV2 Cap蛋白N末端富含大量碱性氨基酸和大肠杆菌稀有密码子，在转运过程中占用大量tRNA，影响大肠杆菌生长和蛋白表达。PPVVP2基因N末端也含有较多的大肠杆菌稀有密码子，部分稀有密码子还是连续的，这给VP2蛋白在大肠杆菌中的表达带来了极大的不便[28]。

针对上述问题，结合前期研究结果，本试验设计截短Cap蛋白N末端的NLS信号肽，以克服由于碱性氨基酸存在而导致的蛋白表达效率低的问题。并根据大肠杆菌的偏嗜密码子设计ORF2基因和VP2基因，优化Cap蛋白和VP2蛋白表达条件，获得了2种溶解性良好的重组蛋白，并通过GEM纯化技术和硫酸铵沉淀技术使蛋白纯度大大提高，经Western-blotting鉴定，重组蛋白可被特异性的抗体识别，具有良好的免疫原性。大量表达Cap蛋白和VP2蛋白制备相应的亚单位单苗和二联疫苗，免疫ICR小鼠，血清学抗体检测结果表明，重组蛋白免疫小鼠后能够诱发良好的体液免疫应答，二联亚单位疫苗免疫小鼠后抗体水平与单苗相当，且在机体内无相互免疫抑制作用。淋巴细胞增殖和相关细胞因子mRNA相对表达量检测结果表明，重组蛋白免疫小鼠后能够有效刺激机体淋巴细胞的增殖，并且可提高IL-4和IFN-γ mRNA表达水平，促进T细胞分化，诱导小鼠产生强烈的细胞免疫应答。对免疫小鼠进行PPV和PCV2混合攻毒试验，结果表明本研究制备的亚单位疫苗可为小鼠提供有效的保护。

4 结 论

利用大肠杆菌表达系统成功获得了溶解性良好的Cap蛋白和VP2蛋白，乳化制苗免疫小鼠后均能诱导小鼠产生较好的体液免疫应答和特异性的细胞免疫应答，并且能够为机体提供较好的保护。