毛晴，陈丰，梁建，刘军锋，吕爱军，胡秀彩，郭永军，邢克智，孙敬锋



菲律宾蛤仔中一株枯草芽胞杆菌的分离鉴定及生物学特征研究

毛晴1，陈丰1，梁建1，刘军锋2，吕爱军1，胡秀彩1，郭永军1，邢克智1，孙敬锋1，通信作者

（1. 天津农学院 水产学院 天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384；2. 天津市渔生堂生物技术有限公司，天津 300404）

从健康菲律宾蛤仔（）肝胰脏中分离纯化出一株细菌，命名为G6，通过形态学观察、生理生化特性、16S rDNA序列测定、系统发育分析等方法鉴定为枯草芽孢杆菌（）。然后对其生长曲线、耐高温、耐酸性、耐胆盐等生物学特征进行研究。结果表明，G6菌株生长期较长，在26～34 h进入稳定期，具有较强的耐高温、耐酸性、耐胆盐等特性。本研究为枯草芽孢杆菌G6菌株作为水产动物益生菌菌株的开发应用奠定了基础。

菲律宾蛤仔；枯草芽孢杆菌；分离；鉴定；生长特性；耐受性

近年来，随着人们对食品安全和生态环境的高度重视，寻求无毒副作用、无药物残留的微生态饲料添加剂已成为研究热点[1]。人们在养殖生产实践过程中证明，益生菌的应用可提高养殖动物生长率、成活率和免疫力。益生菌作为一种绿色环保的新型饲料添加剂[2]，是代替抗生素和化学药物防治水产动物病害的最佳选择，逐步被水产养殖业认可和推广。

枯草芽孢杆菌（）是最常用、最具特色的一类芽孢杆菌，在水产养殖上的应用研究较多，该菌对养殖动物和人无病原性、毒性及毒副作用，易于生产和保存[3]，并且在自然界分布广泛, 国内外均允许将其用于饲料添加剂[4]。但目前现行的大多数枯草芽孢杆菌仍然来自于畜禽微生态制剂，部分商业化产品中菌株来源标示不明确。而益生菌菌株往往具有宿主特异性，因此适用于畜禽的微生态制剂未必能在水产动物体内有效定植[5]。从宿主本身筛选出的土著微生物可以很好地适应环境，更高效地抑制病原菌[6]。研制水产饲用益生菌添加剂的方法是用水产动物体内正常微生物群的成员，经过选种和人工培养，制成活菌制剂，然后再使其在肠道定植，发挥生理作用[7]。目前，研究者从不同水产动物如黄颡鱼[8]、斜带石斑鱼[9]肠道中分离到枯草芽孢杆菌，结果均表明，枯草芽孢杆菌的抗逆性及在消化道中的稳定性均强于其他益生菌，并对动物生长起到促进作用，具有开发成微生态制剂的潜力。但目前未见从贝类中分离枯草芽孢杆菌的有关报道。

从健康菲律宾蛤仔（）肝胰脏中分离纯化出一株细菌，通过形态学观察、生理生化特性、16S rDNA序列测定、系统发育分析等方法鉴定为枯草芽孢杆菌。然后对其生长曲线、耐高温、耐酸性、耐胆盐等生物学特征进行研究。本研究为分离自菲律宾蛤仔肝胰脏中的枯草芽孢杆菌菌株作为水产动物益生菌的开发应用奠定基础。

1　材料与方法

1.1 材料

20只健康2龄菲律宾蛤仔（）取自天津市某贝类养殖基地。

1.2　菌株分离

菲律宾蛤仔体表用75%酒精棉球消毒，解剖并取其肝胰脏，用无菌生理盐水反复冲洗后，加入1 mL预冷的无菌生理盐水，充分匀浆，1 200 r/min，离心2 min，取上清液按10倍稀释法稀释。取原液、10-1、10-2三个稀释度的样品各100 μL，进行MRS培养基（蛋白胨10 g、牛肉浸粉5 g、酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾2 g、柠檬酸氢二铵2 g、乙酸钠5 g、硫酸锰0.05 g、琼脂15 g、吐温80 1 mL、蒸馏水1 L）平板涂布，每个稀释梯度涂布3个平板，于37 ℃恒温培养24 h。

挑取单菌落划线接种于LB琼脂培养基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g、琼脂粉18 g、蒸馏水1 L），在37 ℃生化培养箱中培养24 h，重复划线接种培养2～3 次，得到纯的菌株，进行染色镜检。挑取革兰氏染色阳性的一株，进行编号，命名为G6。再将纯化后的菌株用40%甘油和LB液体培养基1∶1制成菌悬液，保藏于-80 ℃备用。

1.3　生理生化特征

利用微生物生化鉴定管（杭州微生物试剂有限公司）进行生理生化特征研究，结果判定依据参考《伯杰细菌鉴定手册》[10]及《常见细菌系统鉴定手册》[11]。

1.4　16S rDNA序列测定

用水煮法[12]提取菌株G6的总DNA作为模板。用通用引物进行16S rDNA序列的PCR扩增。其中正向引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′；反向引物为1492R：5′-TACGGCTACC TTGTT ACGACTT-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反应体系（25 μL）包括d NTP Mixture 10 μL，引物 27F 1 μL，引物 1492R 1 μL，模板 DNA 2 μL，超纯水11 μL。PCR扩增条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃，1 min，55 ℃，1 min , 72 ℃，1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察，将有目标条带的 PCR 产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测得的序列使用Chromas 2.22软件处理，通过DNAMAN 6.0进行拼接后，登录GenBank（http://www.ncbi. nlm. nih.gov/），对于菌株 16S rDNA 测序的结果，利用Blast功能进行序列比对，并选取相似性较高的菌株，使用Mega 5软件采取Neighbor-Joining 法构建系统发育进化树。

1.5　生长曲线

将菌株G6的活化液按5 %的接种量接入至新鲜LB液体培养基中，37 ℃、150 r/min条件下培养。在600 nm波长下每2 h测定一次菌液值，30 h以后，每4 h测定一次，共持续50 h。

1.6　耐受性

1.6.1 耐酸性试验

参考杨锋等[13]的方法进行耐酸性试验。

试验1：将G6菌液按5% 接种量分别接种于pH为 2、3、4的新鲜LB液体培养基中，37 ℃恒温培养，在600 nm波长下分别测定生长至2 h和6 h菌液的值，将pH为7的液体培养基作为对照组。

试验2：按5%的接种量将G6菌液分别接种到pH 为4、5、6、7、8的新鲜LB液体培养基中，37 ℃恒温培养30 h，在600 nm波长下每2 h测定一次菌液的值。

1.6.2 耐高温试验

将37 ℃恒温培养24 h后的G6菌液，按5%的接种量接种在2 mL的新鲜LB液体培养基中，重新37 ℃恒温培养4 h后取出，在70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃中分别水浴5 min、15 min，然后冷却取出菌液，在600 nm波长下测定菌液值，即为菌液初始值。然后将菌液放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h，在600 nm波长下测定菌液值。没有经过热处理的菌液恒温37 ℃培养作为对照。

1.6.3 耐胆盐试验

取G6菌株培养液按 5% 接种量分别接种于10 mL 质量浓度为0%、0.03%、0.10%、0.20%和0.30%的胆盐溶液中，0 h计数作对照，37 ℃培养24 h后，在600 nm波长下测定菌液值。

2 结果

2.1 形态学观察

G6菌株的菌落呈圆形，略粗糙，表面有褶皱，稍带光泽，乳白色（近蜡状颜色）；光学显微镜下显示菌株G6革兰氏染色呈阳性，染色均匀，呈短链状排列，单个菌体呈杆状。

2.2　生理生化特征

菌株G6的生化特征见表1，V-P反应呈阳性，能利用葡萄糖、木糖产酸，能水解淀粉和还原硝酸盐等。对照《伯杰细菌鉴定手册》《常见细菌系统鉴定手册》中的枯草芽孢杆菌标准菌株的生理生化特征，初步鉴定菌株G6为枯草芽孢杆菌（）。

表1 菌株G6的生理生化特征

注：“＋”表示阳性结果，“－”表示阴性结果

2.3　16S rDNA 序列分析

菌株G6的16S rDNA PCR扩增的产物大小为1 445 bp（图1），测得的序列通过拼接后，再将其16S rDNA序列上传至NCBI中进行BLAST同源性比对分析，发现与（KU179323.1）的同源性为99.93%，筛选7条同源性比较相近的序列和一条外类群的序列，建立比对模型，用Mega 5采取Neighbor-Joining 法构建系统进化树，利用bootstrap 生成1 000个自展数据集对进化树进行可靠性分析。如图2所示，菌株G6与菌株（KU179323.1和AJ276351.1）聚为一支。

图1 菌株G6的 16S rDNA 基因扩增结果

注：M为Maker，G6为菌株G6

图2 基于16S rDNA序列构建系统发育进化树

2.4　生长曲线

由枯草芽孢杆菌G6的生长曲线可见，其适应期不明显，很快进入对数增长期，0～4 h生长速率快，4～24 h生长速率减缓，但菌体浓度仍在增加。26～34 h 达到稳定期，40 h后进入衰亡期（图3）。

图3 枯草芽孢杆菌G6的生长曲线

2.5　耐酸性试验

2.5.1 枯草芽孢杆菌G6在pH 为2、3、4时，枯草芽孢杆菌仍可以缓慢增长（图4A）。

2.5.2 枯草芽孢杆菌G6在pH 分别为4、5、6、7、8的溶液中培养30 h后，发现菌液600值一直呈上升趋势，但在不同溶液中生长情况略有不同。在pH为5、6、7、8的溶液中生长较好（600值在0.6～2.0之间），在pH为4 的溶液中生长较差（600值在0.1～1.6之间）。初始pH为5、6、7、8的菌液，经过20 h培养后，600值相近（图4B）。

图4 枯草芽孢杆菌G6的耐酸性

2.6　耐胆盐试验

枯草芽孢杆菌G6的耐胆盐试验结果显示，在胆盐为0.03%时，枯草芽孢杆菌生长最好，其次为0%、0.10%、0.20%、0.30%。在胆盐为0.30%时，对菌株G6的生长抑制作用最明显（图5）。

图5 枯草芽孢杆菌G6的耐胆盐特性

2.7　耐高温试验

枯草芽孢杆菌G6的耐高温试验结果显示，在70 ℃、80 ℃处理5 min、15 min后，培养24 h，发现菌液600值高于37 ℃对照组（图6 A，B）。在90 ℃、100 ℃处理5 min、15 min后，培养24 h，测得菌液600值低于37 ℃对照组（图6 C，D）。在100 ℃处理15 min后的菌液初始600值与其培养24 h后的菌液600值接近，推测G6菌株在100 ℃处理15 min后失去活性（图6D）。

图6 枯草芽孢杆菌G6的耐高温性

注：A为70 ℃处理，B为80 ℃处理，C为90 ℃处理，D为100 ℃处理

3 讨论

从健康菲律宾蛤仔（）肝胰脏中分离纯化出一株革兰氏阳性细菌，命名为G6，对其进行形态学观察及生理生化特性研究。生理生化试验结果显示G6菌株V-P反应、明胶液化试验呈阳性，能水解淀粉和还原硝酸盐，并且可以利用葡萄糖、木糖产酸，实验结果与《常见细菌系统鉴定手册》中枯草芽孢杆菌标准菌株的生理生化特征基本一致，因此初步鉴定该菌株为枯草芽胞杆菌。但因枯草芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌生理生化相似度较高，常规的生化指标测定只能进行初步判定，并且较难得到正确的鉴定。所以，为进一步确定该菌株，决定采用分子鉴定法。由于16S rDNA基因序列长度适中，遗传信息丰富，既有保守区，也存在种间变异，适合进行细菌分类鉴定和系统发育进化分析[14]。所以，本研究采用16S rDNA基因序列分析对菌株G6的种属进行进一步确认。结果表明，该菌株与枯草芽胞杆菌标准菌株（KU179323.1）同源性高达99.93% ，在系统发育树上与枯草芽胞杆菌标准菌株（KU179323.1）和菌株（AJ276351.1）聚为一支，故进一步确认菌株G6 为枯草芽胞杆菌。

生长特性研究结果表明，菌株G6的生长曲线适应期不明显，直接进入对数增长期，且进入稳定期的时间较长。这可能是由于测定生长曲线时所用接种菌液为枯草芽孢杆菌G6的活化液，所以在测定的生长曲线上没有显示出适应期。

耐受性结果表明，枯草芽孢杆菌G6在强酸条件下生长情况较差，在弱酸性和中性环境中生长旺盛，此结果与杨锋等[13]的实验结果基本一致。耐高温试验结果显示，菌株G6具有较好的耐高温特性，但在100 ℃处理15 min后可以使其死亡。另外，经过70 ℃、80 ℃处理后的菌液在常温培养后，菌液浓度与对照组相比不减反增，推测可能是高温激活了枯草芽孢杆菌中的芽孢，促进芽孢萌发，从而导致枯草芽孢杆菌的繁殖速度加快[10]。研究菌株G6胆盐耐受性的目的在于检测枯草芽孢杆菌是否具有潜在的益生特质。因为细菌在肠道中存活和增殖必须能够耐受一定浓度的胆盐环境，才可以保持足够的活菌数，从而发挥益生作用。本次耐胆盐试验结果显示，菌株G6在胆盐浓度为0.03%的情况下生长情况最好，之后随着胆盐浓度增加，抑制生长作用增大，但是在0.30%的胆盐浓度下，菌株G6仍可继续存活增殖，说明G6具备较高的胆盐耐受性。此结果与钟罗华等[15]报道的猪源芽孢杆菌的耐胆盐特性基本一致。Spinosa等[16]和吴正存等[17]认为，耐胆盐的菌株能够更好地适应肠道环境，更容易增殖生长。因此推测，枯草芽孢杆菌G6能够适应水产动物肠道环境，具有潜在的益生特性，但这还需要进一步的实验验证。

用将益生菌应用于养殖水体或作为饲料添加剂的方法来提高水生动物的自身免疫力并促进其生长，对促进生态健康水产养殖具有实际意义。本研究首次从菲律宾蛤仔中分离到枯草芽孢杆菌，相关生物学特征研究结果将对其在水产养殖中的应用奠定基础。

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责任编辑：张爱婷

Isolation, identification and biological characteristics of afrom

MAO Qing1, CHEN Feng1, LIANG Jian1, LIU Jun-feng2, LÜ Ai-jun1, HU Xiu-cai1, GUO Yong-jun1, XING Ke-zhi1, SUN Jing-feng1, Corresponding Author

（1.Tianjin Key Lab of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Yushengtang Biotechnology Co. Ltd., Tianjin 300404, China）

A bacterium strain was isolated and purified from the hepatopancreas of healthyand named G6. This bacterium strain was identified asaccording to the results of morphological observation, physiological and biochemical characteristics, 16S rDNA sequence, and phylogenetic analysis. Its biological characteristics were studied, including growth curve, resistance to high temperature, acid, and bile salt. Results showed that the strain G6 had a long growth period and a stationary phase from 26 to 34 h and was resistant to high temperature, acid, and bile salt. This report provided a scientific base for application of G6 as the probiotic for aquatic animals.

;; isolation; identification; growth characteristics; resistance

S917.4

A

2018-01-04

国家现代农业产业技术体系项目（CARS-48）；天津市水产产业技术体系创新团队项目（ITTFRS2017009，ITTFRS2017013）；天津市北辰区科技创新专项项目（KJCX-XDZ-KTP-2016-005）

毛晴（1996-），女，本科在读，研究方向为水产养殖。E-mail：mq_9117@163.com。

孙敬锋（1976-），男，教授，博士，研究方向为水产动物病害及免疫学。E-mail：sun_jf@163.com。

1008-5394（2018）02-0042-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.02.011