李汇涓 徐 胜 肖和卫

(广西壮族自治区人民医院，广西 南宁 530021)

脂肪组织不仅是能量储存器官，也是内分泌器官，能够分泌瘦素、脂联素、肿瘤坏死因子(TNF)-α、视黄醇结合蛋白(RBP)4等细胞因子，参与动脉粥样硬化、胰岛素抵抗等代谢性疾病的发生〔1〕。甘精胰岛素作为糖尿病治疗的一线药物，广泛应用于临床治疗。相关研究发现，甘精胰岛素能够纠正糖尿病患者体内血脂代谢紊乱〔2〕，但机制仍未明确。本实验拟分析不同浓度甘精胰岛素对人皮下前脂肪细胞分化和脂质代谢的影响及可能作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 脂肪组织来于广西壮族自治区人民医院行开腹手术的6例患者，男2例、女4例，年龄50.17岁，术前行口服糖耐量试验排除糖尿病，排除严重感染、重要器官和系统功能不全者，本研究经医院伦理委员会审批，组织取材均经患者知情同意。主要试剂：胎牛血清、DMEM培养基、Ⅰ型胶原酶均购于北京北方同正生物技术发展有限公司；脂肪因子检测试剂盒、Trizol试剂盒均购于上海广锐生物科技有限公司。

1.2前脂肪细胞原代培养基鉴定 术中取患者腹部皮下脂肪组织约15 g，磷酸缓冲液洗涤后剪碎，Ⅰ型胶原酶消化，接种至含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养24 h，光学显微镜下观察细胞生长情况。消化传代，取3～5代对数期前脂肪细胞，流式细胞术检测表面抗原(CD44、CD105、CD31、CD34)，鉴定培养的前脂肪细胞相关生物活性。

1.3诱导分化及甘精胰岛素干预 取5～8代对数期前脂肪细胞，调整细胞浓度至1×106/ml接种至6孔板，待细胞完全覆盖后加入无血清分化培养基，前3 d加1 mmol/L的成脂诱导分化剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，诱导2 w后，油红O染色鉴定成脂分化；分化过程中分别加入浓度为125、250、500、1 000 nmol/L的甘精胰岛素进行干预，每3 d收集上清液。

1.4脂肪因子检测 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测分化第3、7、14天前脂肪细胞上清液中脂肪因子瘦素、脂联素、TNF-α、RBP4水平；比色法检测前脂肪细胞中脂质代谢指标三酰甘油含量及甘油释放量；具体操作严格按试剂盒说明进行。

1.5qRT-PCR检测目的基因表达 Trizol法提取前脂肪细胞总RNA，逆转录为cDNA，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-γ、促进结合蛋白(CEBP)α、RBP4、激素敏感性酯酶(LPL)、β-actin引物由上海沪宇生物科技有限公司设计合成。SYBR GREEN Ⅰ染料法在荧光定量PCR仪上扩增，总反应体系20 μl，反应条件：95℃ 40 s;95℃ 10 s;60℃ 30 s;72℃ 1 min，共40个循环。扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，2-△△Ct计算目的基因mRNA相对表达量。

1.6统计学分析 使用SPSS21.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1前脂肪细胞鉴定及诱导分化 流式细胞术检测显示，干细胞表面标志物CD44、CD105呈强阳性，表达率超过97%，而内皮细胞标志物CD31、CD34呈阴性，说明培养的原代前脂肪细胞具有干细胞特性。前脂肪细胞经IBMX成脂诱导分化2 w，细胞呈圆形，胞内可见透亮脂滴填充，部分细胞间相互融合成片；胞内脂滴可被油红O染呈橘红色，见图1。

2.2不同浓度甘精胰岛素对脂肪因子的影响 随着脂肪细胞逐渐分化成熟，瘦素、脂联素分泌量明显增加，TNF-α、RBP4分泌量明显减少。分化第7和14天时，不同浓度组瘦素、脂联素、TNF-α、RBP4分泌量差异均有统计学意义(P<0.05)，中浓度甘精胰岛素(250、500 nmol/L)对瘦素、脂联素分泌的促进作用，对TNF-α、RBP4分泌的抑制作用最明显。见表1。

2.3不同浓度甘精胰岛素对脂质代谢的影响 随着脂肪细胞逐渐分化成熟，胞内三酰甘油含量逐渐增加；甘精胰岛素250、500 nmol/L组三酰甘油含量明显高于125、1 000 nmol/L组(P<0.05)。脂质合成的同时伴随脂质分解，胞内甘油释放量随分化时间的变化不明显，与甘精胰岛素的干预浓度呈正比，甘精胰岛素1 000 nmol/L组甘油释放量明显高于125、250、500 nmol/L组(P<0.05)。见表2。

2.4前脂肪细胞分化过程中基因转录水平变化 随脂肪细胞分化时间延长，各目的基因转录水平逐渐增加，不同时间点PPAR-γ、CEBPα、RBP4、LPL mRNA相对表达量差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表1 不同浓度甘精胰岛素对各分化时间脂肪因子分泌水平的影响

与甘精胰岛素125 nmol/L组比较：1)P<0.05；与250 nmol/L组比较：2)P<0.05；与500 nmol/L组比较：3)P<0.05

表2 不同浓度甘精胰岛素对脂质合成和分解的影响

与甘精胰岛素250、500 nmol/L组比较：1)P<0.05;与甘精胰岛素1 000 nmol/L组比较：2)P<0.05

表3 前脂肪细胞分化不同时间点各目的基因mRNA表达水平

与0、3、7 d比较：1)、2)、3)P<0.05

3 讨 论

近年来，肥胖被归为慢性炎症疾病范畴，脂肪组织可通过分泌多种细胞因子参与糖尿病、动脉粥样硬化等发生〔3〕。本实验结果显示，随着前脂肪细胞分化成熟，瘦素、脂联素、TNF-α、RBP4分泌量均明显增加，中浓度甘精胰岛素对脂肪因子分泌的促进效果最明显。相关研究显示，胰岛素可促进小鼠L1细胞中脂联素的分泌〔4〕。高胰岛素血症、慢性炎症存在于2型糖尿病或肥胖患者中，导致促炎性脂肪因子(TNF-α、RBP4)分泌量增加，当给予胰岛素治疗后，促炎性脂肪因子分泌量减少，抗炎脂肪因子(瘦素、脂联素)分泌量增加，进一步从体外细胞实验证明了胰岛素在人体中的抗炎作用。细胞脂质代谢包括脂质的合成和分解，可分别通过细胞中三酰甘油含量和甘油释放量来反映。相关研究显示，上调PPAR-γ、CEBPα、RBP4、LPL基因表达可提升细胞中cAMP水平，进而促进PKA活性，诱发β肾上腺素受体信号传导，促进脂肪降解〔5〕。本研究显示，甘精胰岛素是促进脂质合成的同时也能够诱导脂肪分解，其中脂质合成与脂肪细胞分化进程有关，中浓度甘精胰岛素对脂质合成的促进效果最明显；但脂质分解与分化进程关系不大，与甘精胰岛素浓度呈正相关，高浓度甘精胰岛素促进脂质分解效果最明显。进一步对前脂肪细胞分化不同时间点目的基因mRNA表达情况分析显示，PPAR-γ、CEBPα、RBP4、LPL mRNA相对表达量随分化时间延长明显提升，可能参与甘精胰岛素对脂肪细胞脂质代谢的调控。