苗利娟，石 磊，韩锁义，黄冰艳，董文召，齐飞艳，房元瑾，张新友

(河南省农业科学院 经济作物研究所/农业部黄淮海油料作物重点实验室/河南省油料作物遗传改良重点实验室，河南 郑州 450002)

花生作为我国重要的油料作物，在农业生产中占据重要地位。近年来，我国花生种植面积逐渐扩大，已成为世界上花生第一生产和消费大国[1]，但由于当前推广的花生栽培品种遗传基础比较狭窄，抗病抗逆性较差，进而影响花生产量和质量进一步提高[2-3]。随着生物技术的快速发展，转基因及离体诱变技术受到广大研究者的重视。遗传转化及离体诱变的成功与否依赖于花生组织培养高效再生体系的建立。研究者们利用花生不同基因型、不同外植体，通过器官发生和胚胎发生途径得到了再生植株，建立了花生高效植株再生体系[4-6]。但花生组培再生苗的根系较弱，其移栽成活率较低，尤其是通过转基因和突变体筛选等技术得到的具有优良性状的花生再生苗难以高成活率移栽，严重影响了后续工作的顺利开展。再生苗嫁接是解决组培苗移栽成活率低的有效手段[7]。嫁接技术在园艺作物上应用较广泛[8-9]，随着嫁接技术的不断发展，嫁接在棉花[10]、油菜[11]和大豆[12]上也有应用，大豆[13]和绿豆[14]等通过远缘嫁接获得变异新种质，目前已突破其传统的繁殖意义，而广泛应用于植物的栽培生产、育种实践和基础理论研究等方面。花生嫁接方面应用报道较少，有研究表明,采用14 d的花生实生苗为砧木，用不同的嫁接方法(劈接法、合接法和插接)，以实生苗和转基因组培苗为接穗，嫁接部位为上胚轴[15]，结果显示劈接法操作简单，成活率高。还有报道无菌嫁接方法，采用12～15 d苗龄的无菌幼苗作砧木，花生组培苗为接穗，嫁接于下胚轴，无菌条件下进行嫁接，之后在无菌培养基上培养使伤口愈合，成活后，取出嫁接苗，用水将嫁接植株根系上的培养基冲洗干净，再移栽到育苗基质中，室内驯化3周，成活后移栽田间[16]。为解决组培苗及转基因苗生根困难及移栽成活率低，以及组培苗移栽后长势较弱等问题，本研究采用劈接法，以不同花生品种实生苗作为砧木，以4个不同类型花生品种的组培苗为接穗，分别采用花生的上胚轴和下胚轴为嫁接部位，对不同品种嫁接成活率及生长情况进行研究，旨在为花生转基因苗及抗性突变体材料的高成活率移栽提供有效的方法。

1 材料和方法

1.1 供试品种

砧木材料：多粒红籽花生品种四粒红(简称四)；黑籽花生品种豫花0215(0215)。

接穗材料：普通大果型花生品种豫花9326(9326)、濮科花16号(P16)；珍珠豆型花生品种豫花22(Y22)、远杂9307(9307)。

1.2 试验方法

1.2.1 砧木材料的准备 选用成熟饱满的花生种子于培养箱中催芽，露白后将种子种植于高压灭菌的蛭石中，室温25 ℃，生长10 d，长出2～3片真叶后作为砧木材料。

1.2.2 无菌组培苗接穗的准备 将4 d苗龄的花生幼叶接种于诱导培养基上，诱导培养3周，形成不定芽后将不定芽转入分化培养基进一步分化，不定芽长出2片叶，约2 cm作为嫁接接穗材料。

1.2.3 嫁接方法及嫁接部位 采用劈接法，嫁接部位为花生的上胚轴和下胚轴。上胚轴的嫁接方法：切除顶芽及侧芽，取子叶节以上的上胚轴部分，用手术刀片从中间垂直劈开，切口0.5～1 cm；以组培苗为接穗，从基部切掉再生苗，下端切成0.5～1 cm的切口，切口保持光滑平整；将接穗插入制备好的砧木材料中，使接穗和砧木紧密接触，用Parafilm封口膜缠紧。下胚轴嫁接切掉子叶以及以上部位，嫁接方法同上胚轴嫁接。嫁接后覆膜保湿，避免阳光直射，适当浇水，7～10 d后去掉薄膜。

1.2.4 嫁接苗的驯化移栽 成活的嫁接苗长出新叶后于傍晚或阴天移栽至大田，移栽前浇透水，避免移栽过程中伤根，搭建遮阳网遮阴，2周后嫁接苗长出新叶，去掉遮阳网，大田常规管理。

2 结果与分析

2.1 不同嫁接部位对花生嫁接成活率及结实率的影响

以上胚轴和下胚轴为嫁接部位，同一品种不同嫁接部位的成活率差别不大，而品种间的成活率差异较大，豫花0215在上胚轴和下胚轴砧木上的平均成活率分别为95%和96%，四粒红在上胚轴和下胚轴砧木上的平均成活率分别为74%和67%(图1)。上胚轴嫁接苗移栽田间后砧木上会有侧芽生长，需经常去掉侧芽，而下胚轴嫁接省去这一环节。上胚轴嫁接由于砧木上侧芽去除不彻底，收获时发现砧木和接穗上均有结果现象(图2A—D)。而下胚轴嫁接无侧芽生长，整株植株只有接穗结果(图2E—H)，并且下胚轴嫁接的结实性优于上胚轴，因此，最佳的嫁接部位为下胚轴。

图1 不同品种砧木及嫁接部位的嫁接成活率

(上)表示嫁接部分为上胚轴；(下)表示嫁接部位为下胚轴。下同图2 不同花生品种不同嫁接部位的结实情况

2.2 不同品种砧木对花生嫁接成活率及结果的影响

分别以豫花0215和四粒红为嫁接砧木，嫁接成活率差别很大，豫花0215作砧木嫁接的成活率平均为94.5%，而四粒红的成活率平均为65.1%，豫花0215作砧木嫁接成活率高于四粒红。豫花0215作砧木的嫁接苗田间长势较旺,结实性较好。部分四粒红上胚轴作砧木的的嫁接苗接穗几乎没有分枝生长，没有果实(图3)，结果表明，豫花0215作砧木优于四粒红。

图3 四粒红和豫花0215为砧木的嫁接成活率

2.3 不同品种花生作接穗嫁接成活率及结实情况

采用4个花生品种的组培苗嫁接到不同的砧木上，嫁接成活率差别较大。珍珠豆类型的花生品种嫁接平均成活率较高，其中豫花22成活率最高，为90%以上，豫花22嫁接到砧木豫花0215上，嫁接成活率达到96%。濮科花16号嫁接成活率最低，成活率平均为84.2%，4个品种的嫁接成活率都在80%以上。田间长势和结实方面，珍珠豆型品种结实性较好(图4)，嫁接部位为上胚轴的嫁接植株，豫花22和远杂9307，除了砧木侧芽结果之外，接穗上也有结果现象，而豫花9326和濮科花16号，基本上都是砧木上结果，接穗上几乎无结果。嫁接部位为下胚轴的嫁接苗，豫花22和远杂9307结实性较好，而豫花9326和濮科花16号的嫁接苗多数是不育株。

图4 不同花生品种接穗的成活率

2.4 花生嫁接苗中不育株的产生

濮科花16号和豫花9326作接穗在2种砧木上嫁接都出现了不育株，2种砧木上嫁接共成活25株，其中濮科花16号在四粒红上嫁接出现6株不育株，在豫花0215上出现6株不育株，不育株占嫁接总数48%(图5A、B)。豫花9326在豫花0215上嫁接成活16株，其中6株不育，不育株占37.5%(图5C、D)。嫁接植株都能正常开花，除了不育株之外，成活的嫁接植株结实性差，只有1～2个果，将不育株组培接种，组培苗移栽田间后，仍然出现不育。

图5 濮科花16号出现的不育株

2.5 花生组培苗的嫁接、驯化移栽及结果情况

通过比较上胚轴和下胚轴2个嫁接部位，上胚轴嫁接是在子叶节以上，操作比较方便(图6A)，而下胚轴大多数在土里，嫁接时需要将下胚轴漏出土面，嫁接时操作有障碍(图6B)，嫁接后覆膜保湿，嫁接7 d后有新叶长出(图6C)，成活后去掉塑料薄膜，逐渐见光培养，7 d左右即可移栽大田，移栽大田后，遮阳网遮阴(图6D)，避免阳光直射，2周后嫁接苗成活去掉遮阳网，正常田间管理，嫁接植株都能正常开花(图6E)，个别品种不结实。

图6 组培苗的嫁接、移栽生长情况

3 结论与讨论

植物嫁接最早起源于我国，是常规的无性繁殖技术，在果树、蔬菜、花卉等许多生产领域应用广泛，通过嫁接提高植株的抗性、增加产量和改变品质等[17]。随着嫁接技术的不断发展，嫁接技术已应用到植物组织培养、基因工程和植物生命科学等领域，例如，棉花从愈伤诱导到到分化成苗需要10个月以上，并且组培苗生根移栽成活率较低，利用嫁接大大提高了棉花转基因植株的移栽成活率[18]，花生也存在类似的情况，最近几年，花生组培苗、转基因植株及诱变后代也采用嫁接方法移栽大田[19]，但都是亲缘关系比较近的同种嫁接，其他作物上有采用远缘嫁接改变后代材料性状的相关研究[20-21]。

本研究采用四粒红和豫花0215实生苗作砧木，这2个品种都有独特的特点，粒色分别为红色和黑色，嫁接后砧木上侧芽有结实情况，非常容易区分，豫花0215作砧木嫁接成活率高于四粒红，并且结实性优于四粒红。豫花0215作砧木，嫁接部位为上胚轴的，收获时发现砧木和接穗上都有结实现象，而四粒红作砧木，嫁接部位为上胚轴时，接穗基本不分枝生长，砧木侧枝生长旺盛，收获时发现只有砧木上有结果，接穗上几乎无结果，这可能与花生品种特性有关，四粒红为农家种，不容易驯化，对外来嫁接枝条有排斥现象。

同一品种不同嫁接部位，嫁接成活率差异不大，不同品种间嫁接成活率存在很大差异，这在其他植物上也表现出嫁接亲和力的差异[22]。嫁接部位为上胚轴时，由于上胚轴离土面较远，更易于操作，嫁接效率高于下胚轴，但下胚轴几乎都在土里，嫁接时需将下胚轴漏出土面，嫁接时操作很受限制，从田间长势及结实情况来看，下胚轴优于上胚轴，上胚轴嫁接的植株，移栽田间后需经常去除侧芽，摘掉后还会在生长，不容易去除干净，收获时发现植株上砧木侧芽有结实现象，并且砧木上侧芽生长旺盛，严重影响接穗的生长及结实，同一植株上既有砧木上结有果实又有接穗上结有果实，而下胚轴移栽后省去了去除侧芽的麻烦，营养更好地供给了接穗，结实情况优于上胚轴，下胚轴是理想的嫁接部位，这与李冠等[19]研究结果一致。但由于下胚轴较短不便于操作，严重影响嫁接速度，今后可以通过其他方法增加下胚轴长度，可以尝试砧木材料采用暗培养做进一步的研究。

不同品种接穗嫁接成活率有很大差别，珍珠豆型的品种嫁接成活率较高，田间长势及结实性也较好，豫花9326和濮科花16号作接穗，嫁接至上胚轴上基本无结果，大多数是砧木侧枝结果；而嫁接至下胚轴的，虽然分枝较多，田间长势较旺，但大多数不结果，出现大量不育株，但不育株都能正常开花，对其花粉育性进行检测，只有10%左右的育性，属于高度不育，出现大量不育株的原因尚不明确，目前有报道，绿豆嫁接到凤仙上出现空夹现象，棉花不同品种嫁接出现不吐絮[23]。这些不育株通过组培保存下来，可以进一步研究，对花粉育性可做进一步测试，还可以借助分子手段做进一步探索。

不同花生品种嫁接，嫁接成活率存在很大差异，不同的嫁接部位嫁接成活率差别不大，比较理想的嫁接部位是下胚轴；通过嫁接可以大大提高移栽成活率，并且田间长势较好，都能正常开花，结实性较好，个别植株出现不育。