陈向齐，宋洪涛，陈胜平，林 兵，刘志宏，昊 霞，翁巧玲

痤疮（acne）是一种慢性炎症性皮肤病，好发于青少年，发病率高达70%～87%。痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes，P.acnes）是引起痤疮的主要病原体。该菌寄生于皮肤毛囊及皮脂腺，属革兰阳性厌氧短杆菌，一般情况下为皮肤正常菌群。当青春期来临时，毛囊口被角栓堵塞，而皮脂腺分泌功能更旺盛，局部厌氧条件、脂肪酸等成分助长了痤疮丙酸杆菌的过度繁殖，从而使其致病。巨噬细胞是固有免疫的免疫效应细胞中的一员，通过固有的模式识别受体对入侵的病原体的病原相关分子模式进行识别，结合后将信号转导到细胞内，激活核转录因子（NF）-κB，启动相关靶基因转录，表达趋化因子、细胞因子，如NO、白细胞介素（IL）-6、IL-10、肿瘤坏死因子（TNF）-α，使巨噬细胞激活，发挥吞噬和杀伤活性[1]。巨噬细胞在先天性免疫和获得性免疫应答中起重要作用[2]。2004年Holland等[3]发现，无瘢痕倾向的痤疮患者早期炎症皮损中有大量CD4+T淋巴细胞、巨噬细胞和朗格汉细胞等细胞浸润，大量表达人类白细胞抗原，局部血管形成并表达血管细胞黏附分子，在24 h到达高峰，然后消退。但5-氨基酮戊酸光动力疗法（5-aminolevulinicacid photodynamic therapy，5-ALA-PDT）能否对小鼠RAW264.7巨噬细胞株的吞噬活性和活性氧自由基（ROS）产生影响，本文进行了研究。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

细胞用DMEM培养基（含10%胎牛血清）进行培养，在37℃、5% CO2培养箱环境下，将小鼠巨噬细胞RAW264.7（购自上海细胞生物研究所）接种于培养皿中。隔天更换培养基，2～3 d进行一次传代处理，0.25%胰蛋白酶消化细胞，处于对数生长期的细胞用于后续的实验。

1.2 方法

1.2.1 灭活细菌液的准备 挑取单个痤疮丙酸杆菌（广东省微生物研究所，ATCC6919）的菌落，并接种于厌氧脑心浸液肉汤培养基中，在37℃厌氧环境下培养3 d，用麦氏比浊法计数，以生理盐水调配细菌浓度至1×108个 /ml，95 ℃水灭活 15 min。

1.2.2 实验分组 空白组：单纯RAW264.7细胞培养。模型组：按文献[4]的方法，给予终浓度2.25×107个/ml浓度痤疮丙酸杆菌灭活液刺激RAW264.7细胞（2.25×105个/ml）2 h。5-ALA-PDT处理组（试验组）：分3个浓度，分别为0.03、0.06、0.12 mmol/L。每组实验重复3次，每次4个复孔，取均值。

1.2.3 中性红法检测巨噬细胞的吞噬活性 RAW264.7细胞以 1×106个/ml铺黑色 96孔板（100 μl），置于培养箱中，培养过夜。除空白组外，其他组给予终浓度1×108个/ml细菌灭活液刺激2 h，感染复数（multiplicity of infection，MOI）=100:1。现配5-ALA液（上海复旦张江生物医药股份有限公司），给予终浓度0.03、0.06、0.12 mmol/L给药，空白组、模型组加等量的PBS液。每个浓度4 个重复孔，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养5 h。给予16 J/cm2的红光照射。吸出旧的培养基，加入新的培养基100 μl，置于培养箱中培养，20 h后取出。巨噬细胞的吞噬活性用中性红法测定，吸出培养基，每孔加0.1%中性红悬浊液100 μl，继续培养30 min。弃去上清液，用200 μl PBS液冲洗未被吞噬的中性红，重复3次。每孔加200 μl细胞裂解液醋酸-乙醇（1:1），静置2 h，使细胞溶解，混匀后在酶标仪上测定 540 nm处吸光度(A)，以无细胞的DMEM培养基培养液为调零对照。

1.2.4 荧光显微镜观察细胞内ROS荧光强度 RAW264.7细胞以 5×104个 /ml铺黑色 96孔板（100 μl），置于培养箱中，培养过夜。除空白组外，其他组给予终浓度5×106个/ml浓度细菌灭活液刺激2 h，感染复数（multiplicity of infection，MOI）=100:1。其余方法同中性红法检测巨噬细胞的吞噬活性。在待测试细胞培养基中加入二氢乙锭（dihydroethidium，DHE，上海西塘生物技术有限公司，最终浓度为10 μmol/L），在37℃5%CO2培养箱内孵育30 min。用预热（37℃）的PBS冲洗3次，每次1～2 min，用荧光显微镜观察细胞内的红色荧光，并拍照。

1.2.5 活性氧自由基检测 细胞培养用荧光显微镜观察细胞内活性氧自由基荧光强度。各孔中加入1:1 000用无血清DMEM稀释2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐（dihydrochloride acetyl acid dichloride，DCFH-DA，上海Sigma公司）探针 30 μl（终浓度 10 μmol/L），在培养箱中孵育30 min后去除探针，用PBS冲洗3遍，彻底清除未结合的荧光探针。每孔加入无血清DMEM 100 μl，在孵箱中继续培养1 h，在485 nm激发波长下，用荧光酶标仪进行检测。

1.3 统计学方法

实验数据以（x¯ ±s）表示，采用SPSS18.0统计软件进行处理，各组间计量资料比较采用单因素方差分析，方差齐时用LSD法，方差不齐时用Tambane's T2法，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 5-ALA-PDT对痤疮丙酸杆菌刺激的RAW264.7细胞吞噬活性的影响

实验结果表明，空白组A值为0.72±0.02，模型组A值为1.06±0.03，0.03 mmol/L组A值为0.91±0.04，0.06 mmol/L组A值为0.89±0.02，0.12 mmol/L组A值为0.76±0.01，用LSD检验，F=99.316，P=0.001，差异有统计学意义。模型组A值和空白组比较，P=0.001，差异有统计学意义。0.06 mmol/L组和模型组比较，P=0.001，差异有统计学意义。0.12 mmol/L组和0.03 mmol/L组比较，P=0.001，差异有统计学意义（图1 ）。

2.2 荧光显微镜观察细胞内ROS的荧光强度

图1 5-ALA-PDT对痤疮丙酸杆菌刺激的RAW264.7细胞吞噬活性的影响

图2 5-ALA-PDT处理对小鼠单核巨噬细胞内ROS水平的影响

图3 5-ALA-PDT对痤疮丙酸杆菌刺激的RAW264.7细胞ROS的影响

荧光显微镜下显示0.03 mmol/L 5-ALA处理组小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株有少量荧光，0.12 mmol/L5-ALA处理组荧光明显增强，表明0.12 mmol/L 5-ALA处理组产生大量ROS（图2）。荧光显微镜下观察细胞内荧光强度可见：0.03 mmol/L组细胞内只见少量微弱红色荧光；0.12 mmol/L组细胞内有大量红色荧光 。

2.3 5-ALA-PDT对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株ROS的影响

空白组荧光强度为0.25±0.01、模型组0.27±0.02，0.03 mmol/L 组 1.32±0.29，0.06 mmol/L 组 1.82±0.32，0.12mmol/L组2.47±0.12，用Tambane's T2检验F=94.865，P=0.001，差异有统计学意义。模型组和空白组比较，P=0.679，差异无统计学意义。0.03 mmol/L组和空白组比较，P=0.026，差异有统计学意义。0.12 mmol/L组和0.03 mmol/L组比较，P=0.012，差异有统计学意义（图3）。

3 讨论

光动力学疗法（PDT）作为光疗法的分支，是一种新兴疗法，用于治疗痤疮疗效显著，不良反应小，已成为目前的研究热点[2,4]。其作用机制是在患处应用光敏剂，在光照的基础上，可以诱导产生独特的生物学效应，从而治愈疾病。以光敏剂5-ALA为例，5-ALA经上皮细胞及毛囊皮脂腺吸收后，可以通过血红素合成途径代谢为原卟啉Ⅸ（protoporphyrin Ⅸ，PpⅨ），当光线照射时，PpⅨ受激发产生单态氧和自由基，使得细胞凋亡，皮脂腺萎缩，痤疮丙酸杆菌被杀灭[5,6]。

巨噬细胞对异物，如细菌等有吞噬和消化的功能，在非特异性免疫反应中起重要作用，中性红法可用来检测巨噬细胞的吞噬活性。笔者的研究结果表明，用痤疮丙酸杆菌刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞后吞噬活性增强，给予不同浓度5-ALA-PDT处理后吞噬活性均降低，随着浓度升高，吞噬活性降低更明显，呈剂量依赖性。表明 5-ALA-PDT能减轻小鼠RAW264.7巨噬细胞株吞噬活性，可能减轻痤疮的炎症反应。

ROS是生物体内含有氧原子和活性物质的总称。除了机体的正常代谢能产生ROS外，免疫反应和抗生素等均可导致ROS水平升高。由免疫系统产生的ROS可直接杀死病原微生物，起到免疫防御作用。荧光显微镜能直接观察到ROS的强度，荧光酶标仪能定量检测ROS水平。在荧光显微镜下观察到小鼠RAW264.7细胞株ROS变化情况：正常情况下小鼠巨噬细胞264.7细胞株ROS水平低，不易观察到，5-ALA-PDT有效增加痤疮丙酸杆菌感染后细胞内ROS水平，随着5-ALA浓度升高，ROS水平持续升高，呈剂量依赖性。可能是5-ALAPDT治疗后产生大量的单线态氧，使ROS水平上升，将痤疮丙酸杆菌杀死，从而治疗痤疮。下一步研究可检测不同处理组单线态氧等不同ROS成分水平，进一步研究5-ALA-PDT对ROS的影响。