周凌云，周 琳，刘红艳，李 维，向 芬，曾泽萱

（湖南省农业科学院 茶叶研究所，湖南 长沙 410125）

中国是茶叶的原产地，有着丰富的茶树资源，茶树品种约占全球品种总数的4/5，但目前报道的茶树病害不及全世界报道病害总数的1/3，茶树病害还存在很多未被识别的种类。茶叶一旦被病原真菌侵染发病，不仅会影响茶树的光合作用，还会使茶叶品质下降，而病害防控的首要前提必须明确其病原菌。一般茶树病害在田间表现症状有差异，在室内不同培养基上展现形态有变化。笔者在茶园中发现有一种从叶缘开始褐变的病斑，形状没有规则，不管是嫩叶还是成叶上，表面均未发现有黑色子实体，在田间与茶轮斑病、茶炭疽病等常见病害的典型表型不完全一致。本试验从长沙茶区采集病害样本，进行褐斑病病原菌的分离，基于其形态学特性和 rDNA-ITS 序列分析进行鉴定，并采用柯赫氏法则进行病害鉴定与致病性分析，以期为该病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病害调查及症状观察

2017年8～12月，于湖南省茶叶研究所试验基地发现茶树叶斑病，采集具有典型症状的2批次病叶，选取具有典型症状的病叶标本，在体视显微镜下观察并记录病害症状。

1.2 病原菌的分离培养、致病性测定

1.2.1 病原菌分离、纯化与培养

采用组织分离法[1]对茶叶斑病样品进行病原菌分离，接种于PDA 培养基、于25℃恒温培养。将生长的菌落进行单孢分离纯化培养后，以进行形态观察与回接致病的实验备用。

1.2.2 病原菌致病性测定

采用菌丝块伤口接种法进行致病性测定。将培养7 d的菌落用打孔器挑选直径为5 mm的菌丝块备用。取健康无病茶叶，接种菌株于茶叶右边，左边接种空白PDA 培养基为对照，28℃下保湿培养，逐日观察叶片的发病情况。

1.3 病原菌形态学与分子鉴定

接种纯化单孢菌株于直径为90 mm的PDA平板上，置于28℃恒温下暗培养7 d后，观察菌落形态，记录菌丝特征。14 d后显微观察分生孢子，观察它们的形态并测量其大小。

将供试菌株接种于 PDA 培养基上，于25℃下培养6 d，收集菌丝，采用SK8255 Ezup柱式真菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取病菌总DNA。采用通用引物ITS1/ITS4[2]，ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’） 与 ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）进行 PCR扩增。

PCR 反应条件：94℃预变性10 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，25个循环；72℃延伸 10 min，4℃∞。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测后，应用SK8131胶回收试剂盒回收，送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将获得的序列于GenBank核酸序列库进行同源性比对分析，并用 Mega 6.0的Neighbor-joining 法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 病害症状

褐斑病发生初期，多从叶缘或叶尖开始出现小斑点，主要发生在成叶上，病斑不整形，灰色或灰褐色，有一褐色边缘（图1-A）。随着病害的发展，病斑中间变成灰白色，易干枯破裂，稍凹陷，浅灰褐色至深褐色，表面未见子实体（图1-B）。

图1-A 嫩叶褐叶斑病症Fig 1-A Tea brown spot disease on tender tealeaf

图1-B 老叶褐叶斑病症Fig 1-B Tea brown spot disease on older tealeaf

2.2 致病性

采用菌丝块接种的方法接种茶叶，接种初期病斑为灰色或灰褐色，有一褐色边缘，茶病斑不整形。接种3 d 菌块边缘表现为水渍状、圆形病斑、有黄色晕圈（图 2-A）；6 d后黄色晕圈明显，病斑呈不规则椭圆形，中心为褐色（图2-B）。且从病斑上均能再次分离纯化出同一种接种菌。

图2-A 病菌回接茶树叶片2 d的形态特征Fig.2-A Morphological characteristics of tea leaves after two days inoculation with pathogenic fungi

图2-B 病菌回接茶树叶片7 d的形态特征Fig. 2-B Morphological characteristics of tea leaves after seven days inoculation with pathogenic fungi

2.3 病原菌的形态特征

分离菌株在 PDA 培养基上不能产孢，菌落正面灰褐色，菌落背面可见褐色轮圈，并呈现扇形墨绿色（图 3-A）。病菌接种茶叶后，接种部位逐渐变褐。通过切片观察，子囊孢子砖格状、具有7个分格，黄褐色，中央部有收缢，大小（28～32）μm×（12～17）μm（图 3-B）。该病菌的形态特征与病原菌为Pleospora camelliaeDippen形态特征相似[3-4]。

图3-A 菌落形态Fig 3-A Colony morphology

图3-B 分生孢子形态Fig. 3-B Conidia morphology

2.4 病原菌的 rDNA-ITS 序列分析

引物ITS1/ITS4从菌株MK4501221基因组中扩增出长度为566 bp的DNA片段（图 4-A）。利用Blast进行同源性比较比对，结果显示病原菌的ITS基因序列与已报道Pleospora sp（寄主茶叶、罗汉果）同源性在99%以上（图 4-B）。构建系统发育进化树显示，菌株与Pleospora sp聚在同一个分支上。结合形态学特征及分子生物学鉴定结果，最终确认此病原菌（Z02）为茶格孢腔菌。

图4-A 病菌PCR电泳Fig.4-A Germicide PCR

图4-B 基于病菌Z02核苷酸序列构建的系统进化树Fig.4-B Phylogenetic tree constructed based on nucleotide sequence of pathogen Z02

3 结论与讨论

叶斑病是茶树的重要病害，引起叶斑病的病原菌分别为茶炭疽病、茶轮斑病及茶云纹叶斑病等[5-7]，而且它们的形态学特征非常相似，难于区分，必须依赖于分子鉴定技术。

格孢腔菌属子囊菌亚门、腔菌纲、座囊菌目、格孢腔菌科、格孢腔菌属（Pleospora）。目前茶叶病害中除了苏联、波多黎各、南非诸国报道格孢腔病菌Pleospora camelliae Dippen的发生[8]，我国仅在江苏、福建发现了一种茶树可培养内生菌Pleospora sp，即Z02中系统进化树中比对的Pleospora sp。本研究发现的致病菌形态描述与Pleospora camelliaeDippen一致，而且致病性测定发现，Pleospora camelliaeDippen可以侵染茶叶成叶产生褐色斑块，符合柯赫氏法则，本研究应用形态学和 rDNA-ITS 序列分析方法，首次鉴定茶格孢腔菌（Pleospora camelliaeDippen）为湖南茶叶褐斑病的病原，为该病害的防控提供了理论依据。